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蛋白抽提产品哺乳动物蛋白抽提试剂盒（CW0002）组织蛋白抽提试剂盒（CW0004）真核膜蛋白抽提试剂盒（CW0005）细菌蛋白抽提试剂盒（CW0001）酵母蛋白抽提试剂盒（CW0003）植物蛋白抽提试剂盒（CW2033）Nc-细胞核/浆蛋白抽提试剂盒（CW0006）第30页，共70页，星期日，2025年，2月5日五蛋白定量产品选择指南第31页，共70页，星期日，2025年，2月5日BCA法蛋白定量（CW0014）BCA（bicinchoninicacid）是理想的蛋白质定量方法。该方法因快速灵敏、稳定可靠，对不同种类蛋白质检测的变异系数非常小而倍备受专业人士的青睐。该方法的原理是，在碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织细胞裂解实验中，低浓度的去垢剂SDS，TritonX-100，Tween不影响检测结果，但螯合剂（EDTA，EGTA）、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类会对检测结果有一定影响。实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用Bradford法测定蛋白浓度。第32页，共70页，星期日，2025年，2月5日Bradford法蛋白定量（CW0013）考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）干扰此法的测定。第33页，共70页，星期日，2025年，2月5日Lowery法蛋白定量（CW0015）Lowry法蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。这个测定法的优点是灵敏度高，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。第34页，共70页，星期日，2025年，2月5日六成功的WesternBlotDiagram通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白原理第35页，共70页，星期日，2025年，2月5日六成功的WesternBlot二抗孵育蛋白提取与定量一抗孵育封闭转膜SDS蛋白变性显影第36页，共70页，星期日，2025年，2月5日蛋白变性Tris-cl(PH6.8)

SDS

GlycerolBromphend-blue

β-巯基乙醇

DTT高温变性,形成蛋白质-SDS胶束加入Samplebuffer沸水浴5min第37页，共70页，星期日，2025年，2月5日SDS产物：三维网状结构凝胶加速剂催化剂单体交联剂缓冲液Tris-Cl四甲基乙二胺（TEMED）丙烯酰胺（Acr）过硫酸胺或核黄素（AP）甲叉双丙烯酰胺（Bis）第38页，共70页，星期日，2025年，2月5日SDS作用缓冲液PH凝胶浓度浓缩胶使蛋白样品浓缩PH6.8Tris-Cl低，2-5%分离胶使蛋白样品分离PH8.8Tris-Cl高，根据蛋白大小电泳缓冲液：PH8.3Tris-甘氨酸-SDS系统。第39页，共70页，星期日，2025年，2月5日SDS-聚丙烯酰胺凝胶最佳分离范围不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。第40页，共70页，星期日，2025年，2月5日聚丙烯酰胺分离胶配方第41页，共70页，星期日，2025年，2月5日SDS灌制分离胶隔绝空气灌好后一般室温放置30－40分