模块五　第十单元　命题情境7　PCR及电泳.pptxVIP

;;;【典题引领】（2024·山东卷）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。;注N代表任一碱基。;(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越__（填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有______种。载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′--______--3′和5′-_______--3′。;解析：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，图中给出的只是载体信息，大豆基因组无法从图中看出，只能根据理论来推测，BsaⅠ切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序。根据图甲所示的载体信息，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′--GTTT--3′和5′-CAAT--3′。;(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素________筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是______，其中纯合的突变植株是__（填序号）。;解析：根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，其中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。分析图乙和图丙可知，目标序列中含有限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ的识别序列，突变序列中含有限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ和SacⅠ的识别序列，再结合电泳结果分析可知，选用的是限制酶SacⅠ切断PCR产物，根据电泳结果图可知，①和③表示杂合子，②表示纯合抗性植株，④表示纯合的突变植株。;(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T--DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为____，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。;解析：根据题意可知，在实验当中获得了1株基因L成功突变的纯合植株，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测发现其体细胞中只有1条染色体有T--DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T--DNA片段上，其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T--DNA（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此如果用抗生素来筛选该植株的自交子代，突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2＝1/4，突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。;PCR类型大汇总和电泳结果分析

1．RT－PCR：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，利用引物和逆转录酶逆转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因表达。RT－PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能，某些病毒的核酸检测就是依据此原理进行的。;2．实时PCR是一种定量测定样品中特定DNA片段的聚合酶链式反应（如图所示）。反应中一般使用带有荧光标记的PCR引物，从而能够通过荧光监测每次PCR循环后扩增所得的产物的量。通过连续监测下获得的反应动力学曲线，可推导出样品中模板DNA的初始含量。;3．重叠延伸PCR是一种PCR定点突变技术。该技术要使用四条引物（如图所示），其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基（包括突变位点）是可以互补的。因此，分别利用引物1和2、引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。;4．大引物PCR也是一种PCR定点突变技术，该技术需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。该技术的流程（如图所示）。第一轮PC