《八角茴香真伪快速鉴别 实时荧光PCR法》征求意见稿.pdf

T/XXXX—XXXX

八角茴香真伪快速鉴别

实时荧光PCR法

1范围

本文件规定了八角茴香（anisistellatifructus）真伪快速鉴别的实时荧光PCR方法。

本文件适用于八角茴香的原果、碎体及粉末真伪的实时荧光PCR鉴定。

检出限（LOD）5%（质量分数）。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3术语、定义和缩略语

术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1.1

八角茴香（anisistellatifructus）

为木兰科植物八角茴香（IlliciumverumHook.f.）的干燥成熟果实。

3.1.2

实时荧光PCRReal-timePCR

在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。

3.1.3

Ct值cyclethreshold

每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

缩略语

下列缩略语适用于本文件。

DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）

PVP-40:聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone)

CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltrithylammoniumbromide)

RNase:核糖核酸酶(Ribonuclease)

TE:三羟甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸(TrisEDTA)

OD:光密度值(Opticaldensity)

4原理

使用基于硅胶柱纯化技术和CTAB前处理方式提取植物源性成分的特异核苷酸片段，以八角DNA为模

板，利用八角物种特异性引物及探针进行实时荧光PCR扩增检测，同时设置阳性、阴性及空白对照。根

据PCR扩增反应产物荧光信号及扩增曲线判定，实现对样品中植物源性成分的定性分析

5试剂和材料

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除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。所有

试剂均用无DNA酶污染的容器分装。

检测用引物和探针

引物和探针序列见表1

表1引物和探针序列

引物名称序列基因来源

verum-1-FTCGATGGTCCCTTGAGGAGTANCBI

verum-1-RGCGCCGATGTTGGTTGTTNCBI

verum-1-PFAM-AGAAACATGGGAGGGTGG-MGBNCBI

注：F代表上游引物；R代表下游引物；P代表探针。

2-巯基乙醇(2-Me)和PVP-40。

灭菌的离心管和枪头。

2mL收集管。

核酸吸附柱。

植物基因组DNA提取试剂盒。

6仪器设备

实时荧光PCR仪。

核酸蛋白分析仪

微量移液器（10μL、100μL、200μL、1000μL）。

恒温振荡金属浴。

离心机（最大离心力≥12000g）。

涡旋振荡器。

组织粉碎机。

电子天平：感量0.