《DNA的粗提取与鉴定》课件.pptxVIP

DNA的粗提取与鉴定

讨论3：怎样才能将细胞内的这些物质分离出来？01讨论1：构成生物体的遗传物质是什么？02

1、提取生物大分子的基本思路选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子2、生物大分子主要指蛋白质、酶和核酸3、提取DNA的基本思路利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分（一）提取DNA的方法

（1）DNA的溶解性1DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反2当氯化钠的物质的量浓度为2mol／L时，DNA的溶解度最大，浓度为0．14mol／L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出3如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？

（2）DNA在酒精溶液中的溶解性DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离（3）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性①蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响②大多数蛋白质不能忍受60－80°C的高温，而DNA在80°C以上才会变性③洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对DNA没有影响

在沸水浴中，DNA遇二苯胺会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂DNA的鉴定甲基绿（绿色）

实验材料的选取01破碎细胞，获取含DNA的滤液02除去滤液中的杂质(纯化)03DNA的析出与鉴定04二、实验设计

（一）实验材料的选取材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取2～3种实验材料）原则：选用DNA含量相对较高、容易提取的生物组织。鸡血合适的材料：原因：一是鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水涨破。

动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗溶液，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？1、动物细胞（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液

2、植物细胞①植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜②实例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解

答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等具体做法：10mL鸡血＋20mL蒸馏水→同方向搅拌→3层尼龙布过滤→滤液讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？

答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质方案一、在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液浓度为2mol/L，过滤除去不溶的杂质，再加入蒸馏水，调节NaCl溶液浓度为0.14mol/L，析出DNA，过滤除去溶液中的杂质，再用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。（三）去除滤液中的杂质

讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离方案二、直接在滤液中加入嫩肉粉，反应10～15分钟。方案三、将滤液放在60～750C的恒温水浴箱中保温10～15分钟。为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质

具体做法:01方案一：30mL滤液＋35gNaCl→同方向搅拌，DNA溶解→加入蒸馏水→DNA析出→过滤得到过滤物→放到2mol/LNaCl溶液中溶解→DNA-NaCl溶解液02方案二：30mL滤液＋嫩肉粉（木瓜蛋白酶）→静置10～15分钟→DNA滤液03方案三：30mL滤液→60～75℃处理→过滤获得DNA滤液04

DNA的析出DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95％），静置2－3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水。DNA的析出与鉴定

鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度