电泳前的准备工作缓冲系统的选择保证蛋白质的溶解性能稳定性以.pptxVIP

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电泳前的准备工作

缓冲系统的选择:

保证蛋白质的溶解性能、稳定性以及生物活性的保持;

电泳时间和分辨率:从理论上讲PAGE可以在任何pH进行,但实际上过酸或过碱的条件下将发生某种水解(脱酰胺)。因此,pH应限制在3-10之间。

缓冲系统的选择原则

是两种标准的对立权衡

如果缓冲液的pH选择在远离样品中各种蛋白的等电点,蛋白质分子所带电荷的密度大,电泳时间短,区带细而窄;

如果缓冲pH选择在靠近被分离样品的一种或几种蛋白质的等电点,则蛋白质分子之间的电荷密度差别大,分辨率就高;

常选择pH8.0-9.5的缓冲,常用的缓冲液有Tris-甘氨酸(pH8.3-9.5),Tris-硼酸(pH8.3-9.3)和Tris-醋酸(pH7.2-8.5)

离子强度的选择

离子强度不宜过高,此时电导率低,产热少,电泳速度快;但也不可过低,必须具有一定的缓冲能力,过低的离子强度容易导致蛋白质絮凝。

一般选择缓冲液的离子强度为0.01-0.1mol/L之间

凝胶浓度的选择

由于PAGE电泳分离不仅取决于蛋白质的电荷密度,而且取决于分子的大小、形状。因此,与凝胶的分子筛效应(即凝胶的孔径与电泳的分辨率、电泳速度)密切相关。

根据凝胶孔径与被分离分子的大小和形状,可以将凝胶分为:

非排阻性凝胶(unrestrictivegel):浓度0.7-1.0%的琼脂糖凝胶;

排阻性凝胶(restrictivegel):浓度大于1%的琼脂糖凝胶和常规PAGE

(一)实验原理:

以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物,电荷、分子大小不一的各种血清蛋白经浓缩效应、电荷效应、分子筛效应而被精细分离,分离效果好,分辨率高。

实例:聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白

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