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犬腺病毒pVAX1-Loop核酸疫苗：构建、表达及免疫效果探究

一、引言

1.1研究背景

犬腺病毒（Canineadenovirus，CAV）是一种广泛存在于犬科动物中的双链DNA病毒，主要包括犬腺病毒1型（CAV-1）和犬腺病毒2型（CAV-2）。其中，CAV-1是引起犬传染性肝炎（canineinfectioushepatitis，CIH）的病原体，这是一种对犬类健康危害极大的急性败血性传染病。幼犬，尤其是1岁以内的幼犬对CAV-1极为易感，一旦感染，发病率和死亡率相对较高。临床上，患病幼犬常表现出精神沉郁、寒颤怕冷、体温急剧升高至40.5℃左右，还伴有贫血、黄疸、咽炎、淋巴结肿大等症状，部分病例会在眼睛上有所表现，如角膜混浊变成蓝色，并有结膜水肿，重者可造成角膜穿孔。最急性病例甚至会在出现呕吐、腹痛、腹泻后数小时内死亡。对于我国实验犬的饲养以及毛皮动物养殖业而言，犬传染性肝炎的爆发会带来巨大的经济损失，严重阻碍行业的健康发展。

CAV-2则主要引发犬的传染性喉气管炎及肺炎，在4月龄以下的幼犬中多发，常造成全窝或全群咳嗽，因而也被称为“犬窝咳”。感染CAV-2的幼犬潜伏期通常为5-6天，发病时会出现持续性发热，体温维持在39.5℃左右，伴有鼻部流浆液性鼻漏，随呼吸向外喷水样鼻液。病情发展后，会从阵发性干咳转为湿性咳嗽，呼吸急促，严重时可导致坏死性肺炎。此外，患病幼犬还会精神沉郁、食欲废绝、肌肉颤抖，口腔咽部检查可见颌下淋巴结肿大、扁桃体肿大、咽部红肿。该病毒还常常与犬瘟热、犬副流感病毒及支气管败血波氏杆菌混合感染，使得治疗难度大增，死亡率居高不下。

目前，预防犬腺病毒感染的主要手段是接种疫苗。传统的疫苗，如弱毒疫苗，在犬腺病毒防控方面发挥了一定作用，但也存在诸多局限性。一方面，弱毒疫苗存在毒力回升的风险，有可能导致接种的犬只反而感染发病，这给犬类健康带来了潜在威胁；另一方面，其生产成本较高，从病毒的分离、培养到灭活等一系列制备工艺复杂繁琐，需要投入大量的人力、物力和财力。而且，使用弱毒疫苗需要犬只终生定期免疫，这不仅增加了饲养者的时间和经济成本，也给实际操作带来了不便。

随着科技的不断进步，核酸疫苗作为一种新型疫苗逐渐进入人们的视野。核酸疫苗主要包括DNA疫苗和RNA疫苗，其原理是将编码抗原的核酸序列导入宿主体内，通过宿主自身的细胞机制表达抗原，从而激发机体的免疫反应。与传统疫苗相比，核酸疫苗具有诸多优势。在安全性方面，核酸疫苗不含有活的病原体，不存在毒力回升的风险，大大降低了疫苗接种后引发疾病的可能性；在生产工艺上，核酸疫苗的制备无需进行复杂的病毒培养和灭活过程，只需通过基因工程技术构建表达载体，生产过程相对简单，成本较低，并且可以快速响应病原体的变异，通过调整核酸序列来制备针对新变异株的疫苗。此外，核酸疫苗能够同时激发机体的体液免疫和细胞免疫，免疫效果更加全面和持久。

本研究聚焦于犬腺病毒pVAX1-Loop核酸疫苗，旨在通过对犬腺病毒的Loop区域进行基因工程改造，构建出pVAX1-Loop核酸疫苗，并深入探讨其在小鼠体内的表达和免疫效果。Loop区域作为犬腺病毒表面结构蛋白的关键部分，在病毒与宿主细胞的识别、结合以及感染过程中发挥着重要作用。对该区域进行改造并构建核酸疫苗，有望为犬腺病毒感染的预防和控制提供一种安全、高效的新方法，具有重要的理论意义和实际应用价值。

1.2研究目的与意义

本研究旨在通过对犬腺病毒的Loop区域进行基因工程改造，将其克隆至真核表达载体pVAX1中，构建pVAX1-Loop核酸疫苗，并对其在小鼠体内的表达情况和免疫效果进行深入探讨。具体而言，在构建阶段，运用分子生物学技术，精准设计引物，通过PCR扩增Loop区域基因片段，确保成功插入pVAX1载体，构建出高纯度、高稳定性的核酸疫苗，并通过酶切、测序等严格的质量控制手段，保证疫苗构建的准确性。在表达研究中，将构建好的pVAX1-Loop核酸疫苗转染至小鼠体内，利用Westernblot、RT-PCR等先进的检测技术，清晰明确地检测Loop基因和蛋白的表达水平，为后续免疫效果研究奠定基础。在免疫效果评估方面，通过对小鼠进行免疫实验，系统地观察抗体水平、细胞免疫反应等关键免疫指标的变化，全面评价该核酸疫苗的免疫效果。

从实际应用角度来看，犬腺病毒感染严重威胁犬类健康，给犬类养殖业、宠物饲养业带来了巨大的经济损失。目前的弱毒疫苗存在诸多弊端，如毒力回升风险高，这意味着疫苗本身有可能使接种的犬只感染发病，给犬类健康埋下隐患；生产成本高昂，从病毒的分离、培养到灭活等一系列复杂的制备工艺，需要投入大量的人力、物力和财力