任务3酶活性测定项目六含量测定14课件.pptVIP

项目六

含量测定任务3：酶活性测定

任务3酶活性测定目标：了解酶活性测定的基本原理和方法掌握木聚糖酶活性测定的方法

木聚糖木聚糖酶寡糖单糖知识点：木聚糖酶测定原理3，5-二硝基水杨酸(DNS)沸水浴显色反应，分光比色测定

知识点：木聚糖酶活性单位定义在37℃、pH为5.50的条件下，每分钟从浓度为5mg/mL的木聚糖溶液中降解释放lμmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。木聚糖酶活性单位：

准备试剂氢氧化钠溶液，浓度为200g/L乙酸溶液，浓度为0.1mol/L乙酸钠溶液，浓度为0.1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液，浓度为0.1mol/L，pH为5.50木糖溶液(C5H10O5)，浓度为10.0mg/mL木聚糖溶液，浓度为100mg/mLDNS试剂

准备仪器实验室用样品粉碎机或碾钵分样筛:孔径为0.25mm分析天平:感量0.001gpH计:精确至0.01磁力搅拌器:附加热功能电磁振荡器烧结玻璃过滤器:孔径为0.45μm离心机:最大离心加速度不小于2000g恒温水浴锅：温度控制范围在30℃-60℃之间，精度为0.1℃秒表:每小时误差不超过5S可见分光光度计移液器：精度为1μL

准备样品称样量称取试样两份，精确至0.001g。加入40mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液。磁力搅拌30min，再用缓冲溶液定容至100mL，在4℃条件下避光保存1h-2h。上离心机1000g离心3min-5min，取上清液，再用缓冲溶液做适当稀释(稀释后的待测酶液中木聚糖酶活力最好能控制在0.04U/mL-0.10U/mL之间)。

标准曲线绘制试剂空白标准溶液1标准溶液2标准溶液3标准溶液4标准溶液5标准溶液6标准溶液7木糖溶液-1.02.03.04.05.06.07.0缓冲液--100-100-100-100-100-100-100吸取（至刻度试管）-2.02.02.02.02.02.02.0缓冲液4.02.02.02.02.02.02.02.0DNS5.05.05.05.05.05.05.05.0振荡3-5秒，沸水浴加热5分钟，自来水冷却到室温，加水定容至25mL。以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度A值。以木糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴，绘制标准曲线。

样品测定AB值AE值吸取10ml木聚糖溶液，37℃平衡20min吸取10.0mL经过适当稀释的酶液，37℃平衡10min吸取2.00mL，加入到刻度试管中吸取2.00mL，加入到刻度试管中加入5mLDNS试剂，电磁振荡3s-5s，加入2.0mL木聚糖溶液加入2.0mL木聚糖，电磁振荡3s-5s37℃保温30min，37℃保温30min。加入5.0mLDNS试剂，电磁振荡3s-5s。沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁振荡3s--5s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度AB沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁振荡3s-5s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度AE

计算XD-----稀释酶液中木聚糖酶的活力，U/mL;AE----酶反应液的吸光度;AB------酶空白样的吸光度;K-------标准曲线的斜率;Co------标准曲线的截距;M-----木糖的摩尔质量，M(C5H10O5)=150.2g/mol;t-------酶解反应时间，min;1000-----转化因子，1mmol=1000μmol。XD值应在0.04U/mL-O.10U/mL之间。试样酶活力的计算：

计算X------------试样中木聚糖酶的活力，U/g(或U/mL);Df-----------试样的稀释倍数酶活力的计算值保留三位有效数字。试样酶活力的计算：

重复性每个试样应取两份平行样进行分析测定，相对误差不超过8.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值。

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