荧光共振能量转移FER.pptxVIP

陈同生华南师范大学信息光电子科技学院荧光共振能量转移

FluorescenceResonanceEnergyTransfer(FRET)

分子能级与荧光S0S1T1hn0hn1hn22.荧光（Fluorescence)：当处于基态的分子吸收光能后进入激发态，并且立即返回基态并以光的形式释放能量，这种光称为荧光。4.激发(Excitation,Ex)和发射(Emission,Em)光谱（Spectra):1.能级（EnergyLevel）：原子的可能状态是不连续的，因此各状态对应能量也是不连续的。包含电子能级、振动能级和转动。3.磷光（Phosphorescence）:分子从激发三线态返回基态以光的形式释放能量。

荧光共振能量转移(FRET)现象CFPEx.440nmEx.470nmEm.470nmYFPEm.535nm3.FRET现象的特征:选择性激发供体,却能检测到受体发射的荧光1.供体(Donor,D)Donor2.受体(Acceptor,A)Acceptor

FRET原理(Principle)

FRET的条件发生FRET需要三个条件：1、供体分子的发射光谱和受体分子的吸收光谱必须有显著的重迭，一般大于30％；2、供体分子和受体分子间的距离必须在1–10nm之间.D和A间的FRET效率：3、供体分子的发射态偶极矩与受体分子的吸收态偶极矩、以及它们的向量必须满足一定的条件R0:E=50%时供体和受体分子间的距离.对于特定的供体受体对是常数;R:供体和受体分子间的距离.E:FRET效率.对于R特别灵敏.举例:假设R0=5nm,

1）R=10nm,E=1.5%2）R=5nm,E=50%3）R=6nm,E=25%450500550600l(nm)DEmAEx

FRET的应用通过FRET技术可以获得有关两个蛋白分子之间相互作用的空间信息。常用于解决如下问题:蛋白分子的共定位;蛋白分子聚合体;转录机制;转换途径;分子运动;蛋白折叠等生物学问题.

LaserLaserDAFRET技术应用一:检测两个发光分子间的重合与共定位

荧光标记

利用FRET技术检测不发光分子间相互作用的策略

FRET技术应用二:检测分子间的相互作用Laser

FRET技术应用三:检测分子的折叠与构象变化Laser

FRET技术应用举例：细胞内钙离子浓度的实时测量MiyawakiA,etal.,Nature1997,388:882-887(b)

BFP-GFP

BFP-YFP

CFP-YFP

CFP-dsRED

GFP-dsRED在FRET实验中经常使用的

供体-受体荧光分子对2.绿色荧光蛋白类(GreenFluorescentProteins,GFPs)1.染料类(Dye)FITC-Rhodamine

Alexa488-Cy3

Cy3-Cy5

参考阅读文献JonathanD.Violin,etal.,AgeneticallyencodedfluorescentreporterrevealsoscillatoryphosphorylationbyproteinkinaseC.JCellBiology,2003,161:899–909ElizabethAJetl.,FRETImaging.NatureBiotechnology,2003,21:13887-1395RajeshBS.Fluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)microscopyimagingoflivecellproteinlocalizations.JCellBiology,2003,160:629–633JinZhang,etal.,.GeneticallyencodedreportersofproteinkinaseAactivityrevealimpactofsubstratetethering.PNAS,2001,98:14997–15002MichaelG.Erickson,etal.,DsRedasaPotentialFRETPartnerwithCFPandGFP.BiophysicalJournal,2003,85:599–611AlexanderSorkin,etal.,InteractionofEGFreceptorandGrb2inliv