细胞原代培养与传代.pptxVIP

目录细胞培养基本概念细胞培养基本要求细胞培养基本技术

细胞培养定义定义：模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。优点：1．活细胞：同时、大量、均一性、重复性；2．可控制：各种物理、化学、生物等因素可调控；3．研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记；4．应用广：不同物种、不同年龄、不同组织、正常或异常（肿瘤）；缺点：人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同；当细胞被置于体外培养后，生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了，必然发生变化。

传代：原代培养细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。细胞培养的基本概念

接触抑制（Contactinhibition）细胞相互接触时，将停止增长；细胞停留在细胞周期的G0期；转化的细胞却可以继续生长导致细胞重叠堆积生长。

细胞传代次数（PassageNumber）体外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数有一定的界限，称为“Hayflick极限”。01传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传代140次。02传代次数与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代；幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病儿童，2-10代。03

克隆（clone）亦称无性繁殖系或无性系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。原代培养与细胞系1原代培养?（primary?culture）从动物机体取出的进行培养的细胞群。生长缓慢，繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长。2胞株（cell?strain）从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。3系（cell?line）从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖?

原代培养期01传代期02衰退期03原代培养细胞的生命归宿

TheAmericanTypeCultureCollection(ATCC)TheEuropeanCollectionofAnimalCellCulture(ECACC)NationalInstituteofHealth(NIH),USANationalCancerInstitute(NCI),USA细胞系资源

有限细胞系，无限细胞系细胞系cellline细胞株cellstrain

A培养细胞的生长方式B贴附生长：C必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞D悬浮生长：E于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞培养细胞的特性

04对数生长期05停止期（平台期）01游离期02贴壁期03潜伏期每代贴附生长细胞的生长过程

游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一4小时

血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。贴壁期：底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）

潜伏期此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。

对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。

停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度依赖性

常用仪器设备01培养器皿02培养基03血清04其他细胞培养试剂05二、细胞培养基本要求

培养细胞生长的条件细胞的营养需要细胞的生存环境温度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-渗透压无污染无毒

01超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸02CO2培养箱03倒置显微镜04酶标仪、微孔板震荡器05液氮罐06自动双重纯水蒸馏器，纯水仪07耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管常用仪器设备

培养皿和培养板等表面消毒超净工作台：为细胞操作提供无菌环境滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血