蛋白质不稳定性【共52张PPT】.pptVIP

六、包含体的分离纯化与溶解2、包含体的纯化原因：蛋白质的折叠复性和包含体的形成为动力学竞争的结果。也就是说，蛋白质的复性是分子内折叠和分子间聚集反应的竞争动力学过程。因此，为了提高蛋白质的复性收率，必须抑制聚集体的生成，促进复性反应向正确折叠的方向进行。研究表明：在质粒DNA、脂多糖和其他蛋白质存在时，蛋白质的聚集体生成速率增大，复性收率降低，而纯化的变性/还原蛋白质的复性收率可以得到大幅度的提高。因此，包含体的纯度对复性收率影响显著，为了实现较高的蛋白质复性收率，必须进行包含体的纯化。六、包含体的分离纯化与溶解方法：包含体的纯化过程因表达系统和表达产物而异，没有通用的最佳方案。因此，对于特定的表达系统和表达产物，需要根据具体情况进行过程开发试验，确定适宜的纯化方案。经常采用的包含体分离纯化过程包括差速离心和反复洗涤步骤，以最大限度地清除难以去除的膜蛋白质。可参考的一般过程如下：六、包含体的分离纯化与溶解路线1：①细胞破碎。为提高下一步的离心分离效率，需进行高强度的破碎（利用高压匀浆破碎时需反复操作多次）。②离心沉降回收包含体。在较高的离心机转数（离心力）下除去可溶性组分和沉降速度较小的细胞碎片，回收沉降的粗包含体。③粗包含体的洗涤。向粗包含体中加入鳌合剂EDTA(乙二胺四乙酸)和低浓度变性剂（如1-4mol/L尿素，或1一2mol/L盐酸胍）或表面活性剂（如1-20g/LTritonX-100聚氧乙烯烷基酚),溶解吸附在包含体表面的磷脂和膜蛋白质。同时加入一定浓度的蔗糖，提高包含体悬浮液的密度。AKaIKrN但物理不稳定现象一般可以通过特定的途径恢复其空间结构，而恢复原有的活性，我们称这一过程为蛋白质的复性。重组蛋白质的过量表达常常导致其在胞内发生错误折叠和聚集，形成被称为包含体的集聚体。即：U↑则I↑,N↓。注意：溶解后的包含体蛋白质中仍会存在一些诸如非目标蛋白质、核酸和细胞膜组分等杂质，为了提高复性收率，在复性前要对变形/还原的蛋白质进一步纯化。使用分子伴侣进行蛋白质复性有一定的局限性：首先是分子伴侣本身是蛋白质，应用成本较高；蛋白质一旦发生了化学不稳定，就会完全丧失其原有生理活性，产生新的功能活性或完全丧失生物活性。主要原因是蛋白质本身具有易于聚集沉淀的性质，或表达产物周围的物理环境（如温度、离子组成）不适或某些折叠辅助因子（分子伴侣）的作用。⑤包含体洗涤：向上述悬浮液中加人TritonX-100至20g/L,NaCl至1.六、包含体的分离纯化与溶解因此，在这类添加剂的存在下，由于复性速率较低，需要较长的复性时间（(5-40h)才能获得较高的复性收率。换句话说，对于任何蛋白质和任何表达系统，在过量表达的情况下都可能形成包含体。低浓度变性剂（如盐酸胍）可诱导酸变性蛋白质二级结构的生成，稳定复性过程中的熔球态中间体。3g/ml，高强度的机械破碎后，低速离心便可沉淀，从而使之与细胞碎片和可溶性产物分离。包含体分离的最常用的方法就是：机械破碎后进行离心沉降和膜分离（洗滤）。六、包含体的分离纯化与溶解④离心沉降回收包含体。在较低的转数下离心分离，回收沉降的包含体。⑤根据需要，可重复上述步骤③和④，直至达到满意的包含体纯度。六、包含体的分离纯化与溶解细胞破碎可采用机械破碎和酶解相结合的方法，以提高破碎效率。包含体纯化过程中也可利用核酸水解酶，提高核酸去除率。DeBernardezClark等提出的利用酶解辅助细胞破碎和包含体纯化的过程如下（路线II)：①离心分离，回收细胞。②向回收的细胞中加入含lmmol/LEDTA和1.5mg/mL溶菌酶的Tris缓冲溶液（三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液）(0.lmol/L,pH=7.0)，细胞浓度为20g/L（湿重），总体积为V。放置30min。六、包含体的分离纯化与溶解③细胞破碎：反复机械破碎，使细胞破碎完全。④核酸水解：向细胞破碎液中加入DNA水解酶(DNase）至10μg/mL和MgCl2至3mmol/L。25℃温浴30min，水解DNA。⑤包含体洗涤：向上述悬浮液中加人TritonX-100至20g/L,NaCl至1.5mo1/L,EDTA至20mmo1/L,悬浮液体积为3V。4℃搅拌30min。⑥离心分离回收包含体。⑦包含体洗涤：向回收的包含体中加入Tris至0.lmol/L(pH=7.0),EDTA至20mmol/L,悬浮液体积为8V。⑧离心分离回收纯化的包含体。六、包含体的分离纯化与溶解3、包含体的溶解目的：获得适当纯度的包含体后，需要对包含体进行溶解，使目标蛋白质的肽链伸展，为进一步的复性创造条件。方法：包含体溶解的方法：