嗜热脂肪芽孢杆菌甲醇脱氢酶的定向进化研究.pdfVIP

摘要

甲醇是一种来源广泛的有机一碳化合物，能从二氧化碳、天然气等可再生资源中

生产，极有潜力成为现代生物发酵产业的下一代非粮食来源的替代原料。微生物甲醇

代谢的第一步反应是由甲醇脱氢酶（Mdh）催化甲醇生成甲醛，但由于Mdh天然的酶

学性质较差，甲醇氧化成为一碳代谢的限速步骤，极大地限制了甲醇生物转化效率。

因此，开发高通量筛选方法，定向进化Mdh获得高活性突变体，对提高微生物甲醇利

用能力至关重要。

首先，本研究以甲醛诱导型启动子P为基础，构建了甲醛生物传感器，并通过

frm

转录水平和翻译水平的优化，实现了对0-100μM甲醛的线性响应。此外，对Mdh的

表达水平进行优化，使野生型Mdh产生的荧光信号维持在较低水平，为Mdh活性的

提升提供响应空间。

其次，本研究以嗜热脂肪芽孢杆菌DSM2334来源的MdhBs为研究对象，构建了

全基因随机突变文库和靶向底物结合口袋定点饱和突变文库，应用甲醛生物传感器进

行高通量筛选，并应用Nash检测进行复筛，最终获得6个体内活性提升32%-193%的

突变体，其中MdhV79A、MdhN214D+E309K和MdhK72T+T153P突变体的比酶活分别是野生型

的1.2倍、2.1倍和2.5倍，MdhN214D+E309K和MdhK72T+T153P突变体的KM值分别下降

39%和67%，Kcat/KM值分别是野生型的3.1倍和6.5倍。

最后，对MdhK72T+T153P突变体进行单位点活性的探究，发现T153P是提高催化活

性的关键突变。T153定点饱和突变表明T153位点存在明显的氨基酸替换规律，T153

残基在空间上靠近醇类底物结合口袋，可能是通过影响底物结合影响催化活性的。分

子动力学模拟实验表明MdhT153S对蛋白结构没有显著影响，而MdhT153P将所在的-螺

旋切割成2个小的-螺旋，且相互作用网络发生大幅改变。MdhT153F在F153与L157

之间形成-H键，这可能是芳香族氨基酸取代导致Mdh失活的原因。

综上，本课题针对甲醇脱氢酶酶学性质较差的问题，建立了基于甲醛生物传感器

和Nash检测相结合的高通量高准确性的筛选方法，对MdhBs进行了定向进化，筛选

到了酶学性质显著改善的突变体，进一步解析发现T153残基是提高Mdh催化活性的

关键位点。本研究为甲醇高效利用提供了有效元件，并提供了一个重建T153残基与

周围残基相互作用网络的进化策略，也为研究甲醇脱氢酶活性机制奠定了理论基础。

关键词：甲醇脱氢酶；甲醇氧化；甲醛生物传感器；Nash检测；定向进化

ABSTRACT

Methanolisanorganiconecarboncompoundwithavarietyofsources,whichcanbe

producedfromrenewableresourcessuchascarbondioxideandnaturalgas,andhasgreat

potentialtobethenextgenerationofnon-foodsourcealternativefeedstockforthemodern

biologicalfermentationindustry.Theinitialstepofmethanolmetabolisminmicroorganisms

istheoxidationofmethanoltoformaldehyde,whichiscatalyzedbymethanoldehydrogenase

(Mdh).ButduetothepoorenzymaticpropertiesofMdh,methanoloxidationisconsidered

asarate-limitingstepinone-carbonmetabolism,whichgreatlylimitestheefficiencyof

methanolb