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快速分析几种水产动物病因的方法研究

第一章LAMP技术的发展及其在水产养殖动物疾病诊断中的应用

PCR技术

自1985年发明以来，在病原检测领域得到了广泛应用，但是人们一

直未间断探索更为特异、敏感、快速、简便的方法。日本学者Notomi等

于2000年发明了一种全新的核酸扩增技术——环介导恒温扩增(loop-

mediatedisothermalamplification,LAMP)。该法在保持PCR技术优点

的基础上，进一步增强了反应特异性，缩短了检测时间；特别是它不需要

使用昂贵的热循环仪，在等温条件下就能完成反应，更便于推广应用。自

报道以来LAMP技术受到越来越多的关注，目前相关报道已有180多

篇。LAMP技术已经成为常规的核酸检测方法(NATs)(Morietal.,

2009)，多种人类病原微生物的LAMP检测试剂盒已经被开发。2004年，

该技术首次用于鱼类致病菌迟钝爱德华氏菌的检测(Savanetal.,

2004)。随后，LAMP技术在水产养殖病害领域的报道逐渐增多。本文就

LAMP技术的发展历史及在水产养殖动物病原微生物快速检测中的应用做

一综述。

1LAMP技术的发展

LAMP技术是一种新型核酸扩增技术，由日本学者Notomi等发明。

该技术针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，分别为内引物FIP和

BIP、外引物F3和B3(图1.1)，利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNA

polymerase)在恒温条件(60～65℃)催化新链合成，一个小时内将目的

DNA从几个拷贝扩增到109～1010(Notomietal.,2000)。LAMP扩增可

以分为三步，即扩增反应起始、反应起始物形成和循环延伸。作为核酸扩

增的经典方法，PCR目前已广泛应用于科学研究的众多领域，并成为分子

生物学技术如分子克隆的常规方法。与其相比，LAMP技术检测时间更

短，操作更为简便，又因为其反应中的Bst聚合酶较rTaq酶对抑制物不

敏感，灵敏度更高。自2000年报道以来，LAMP技术在基本扩增机制、反

应产物检测方法及其应用等方面都有了很大的发展，并已逐渐成为一种快

速诊断工具。

2002年，NagamineLAMP反应中引入一对环引物(Loop-primers,

LF和LB)，它能明显加快恒温扩增的速度，大大提高检测效率。环引物结

合于LAMP扩增产物的F2和F1之间(或是B2和B1之间)，以F1到F2的

方向或是B1到B2的方向杂交(图1.1)。它能结合的区域在已经与内引物

杂交的情况下，不能再和环引物杂交，这样，所有的茎环DNA或者与内引

物杂交，或者与环引物杂交，因此加快了扩增速度(Nagamineetal.,

2002)。目前，环引物也越来越多的用于实际的LAMP检测中。另外，反应

体系中增加逆转录酶，还可以对靶RNA进行扩增，进而用于RNA病毒的检

测(RT-LAMP)。LAMP引物的设计比常规PCR要复杂的多，这使许多科研工

作者望而却步。Notomi对LAMP引物设计的原则做了详细的介绍(Notomi

etal.,2000)，研究者可以作为参考人工设计引物。目前已有

专门的LAMP引物设计软件，如PrimerExplorerV3用户只需

提交目的片段序列，设置相关参数，系统便能给出多种引物组合供选择。

必威体育精装版版本的软件还可以考虑靶核酸序列的突变位点，设计对突变位点敏感

或者不敏感的引物。

2LAMP技术在水产养殖动物病原检测中的应用

核酸扩增是生命科学领域最具价值的工具之一，对水产病原微生物

检测及临床医学上传染性疾病、基因紊乱和基因特性的诊断具有独特的应

用价值。与其他核酸扩增方法相比，LAMP技术应用于病原体检测具有无

法比拟的优势(表1.1)。LAMP法操作简单，仪器设备只需要一个水浴锅即

可，总费用较低、耗时短，只要1h左右即可完成扩增反应；反应产物可

以直接通过肉眼观察，具有简单、快速、特异性强、扩增效率高等特

点。LAMP技术发展初期主要应用于食源性微生物的检测。沙门氏菌

(Salmonella)、军团菌(Legionella)、利斯特菌(Listeria)、产志贺毒素

大肠杆菌