第四章基因工程的主要技术及其原理.ppt

PCR反应条件PCR过程第88页，共146页，星期日，2025年，2月5日PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR技术第89页，共146页，星期日，2025年，2月5日PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃PCR技术复习第90页，共146页，星期日，2025年，2月5日PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR技术第91页，共146页，星期日，2025年，2月5日PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR技术第92页，共146页，星期日，2025年，2月5日PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始PCR技术第93页，共146页，星期日，2025年，2月5日PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR技术第94页，共146页，星期日，2025年，2月5日PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束PCR技术第95页，共146页，星期日，2025年，2月5日PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增PCR技术第96页，共146页，星期日，2025年，2月5日2PCR技术的特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍第97页，共146页，星期日，2025年，2月5日2）特异性引物引物引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。第98页，共146页，星期日，2025年，2月5日引物设计：（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。第99页，共146页，星期日，2025年，2月5日3）操作简便易行PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。通常的DNA扩增法是分子克隆法,首先要构建含有目的的基因的载体,然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时间。第100页，共146页，星期日，2025年，2月5日目的基因载体复制子宿主细胞扩增扩增提取DNA分子第101页，共146页，星期日，2025年，2月5日4）用途广泛生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学第102页，共146页，星期日，2025年，2月5日PCR的反应体系和方法PCR管加热使模板变性,退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温(72℃),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。?第103页，共146页，星期日，2025年，2月5日条带比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”条带？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲样品盐浓度过高