实验五拟南芥插入突变纯合体的鉴定.ppt

关于实验五拟南芥插入突变纯合体的鉴定第1页，共20页，星期日，2025年，2月5日实验目的1．熟练掌握植物基因组DNA快速提取的方法；2．掌握利用PCR方法鉴定拟南芥T-DNA插入突变体的方法。第2页，共20页，星期日，2025年，2月5日T-DNA插入鉴定的原理第3页，共20页，星期日，2025年，2月5日突变体鉴定的步骤T-DNA插入基因的基因组序列；T-DNA插入方向的确定；T-DNA插入位置的确定；引物设计；PCR扩增；电泳检测。第4页，共20页，星期日，2025年，2月5日T-DNA插入基因的基因组序列第5页，共20页，星期日，2025年，2月5日点击基因编号进入网页第6页，共20页，星期日，2025年，2月5日点击sequenceviewer进入第7页，共20页，星期日，2025年，2月5日点击nucleotideview进入第8页，共20页，星期日，2025年，2月5日点击突变体编号后进入的网页第9页，共20页，星期日，2025年，2月5日进入网站/cgi-bin/tdnaexpress查找基因突变体及插入方向第10页，共20页，星期日，2025年，2月5日第11页，共20页，星期日，2025年，2月5日基因方向T-DNA方向5’引物3’引物实验设计第12页，共20页，星期日，2025年，2月5日引物设计基因上面引物的设计可以通过下面提供的拟南芥网站/tdnaprimers.html进行自动生成，也可以根据自己的需要进行设计。一般进行鉴定的引物距离T-DNA插入的位置300bp以上为宜，即300+Nbp。LBa1ofpBIN-pROK2forSALKlines：TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG第13页，共20页，星期日，2025年，2月5日植物基因组DNA的快速提取（1）取植物叶片（拟南芥一片叶子），置于1.5ml离心管中，加入400ml提取缓冲液；（2）用研磨棒研磨植物材料，直至缓冲液变为绿色；（3）在台式离心机上13000rpm离心5分钟；（4）离心后将上清300ml转移至一个新的1.5ml离心管中；（5）在上清中加入300ml异丙醇，混匀后于室温下13000rpm条件下，离心5分钟；（6）弃上清后，用70%乙醇润洗沉淀，并在室温下干燥沉淀；（7）100mlTE溶解沉淀，将制备好的样品在4℃保存备用。（此方法提取的基因组DNA只适用于PCR的鉴定，不适合酶切和大片段基因的扩增）第14页，共20页，星期日，2025年，2月5日