《基因工程》第6章_DNA重组的操作-教学课件（非AI生成）.ppt

四、免疫化学检测法(四)免疫印迹（westernblotting）法1.原理（2）Westernblotting②Blotting原理与ELISA相同。待测蛋白硝酸纤维素膜一抗二抗辣根过氧化物酶底物产物，并发出光PAGE胶待测蛋白底片曝光辣根过氧化物酶：HRPO四、免疫化学检测法(四)免疫印迹（westernblotting）法1.原理（2）Westernblotting③Blotting过程1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与膜上的蛋白结合。2）洗去未结合的一抗。3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。4）清洗掉未结合的二抗。5）用HRPO的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，冲洗胶片。ImmunoBlotting四、免疫化学检测法④结果多克隆抗体Blotting的结果单抗blotting结果五、核酸序列分析及其他方法(一)PCR扩增检测法1.原理：PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片段。2.过程（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。（2）用外源DNA插入片段引物作PCR。（3）电泳PCR产物。（4）检查是否有PCR产物。（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。五、核酸序列分析及其他方法(二)DNA序列测定法五、核酸序列分析及其他方法(二)DNA序列测定法五、核酸序列分析及其他方法(三)DNA序列测定法小结一般克隆与筛选策略本章重点掌握内容掌握转化、转导、转染的概念与区别掌握外源基因与载体的连接方式了解基因转移的方法与区别掌握转化子、重组子、选择和筛选的含义?-半乳糖苷酶显色反应选择法的原理核酸杂交法的原理与方法OVer!!!!0****二、核酸分子杂交检测法(二)核酸杂交检测方法3.R-环检测法鉴定出双链DNA中存在的与特定RNA分子同源区域在临近双链DNA变性温度下和高浓度的甲酰胺溶液中（70%），双链的DNA-RNA分子比双链的DNA-DNA分子更加稳定。在这种条件下，RNA会同它的双链DNA分子中的互补序列退火形成稳定的RNA-DNA，而被取代的另一条DNA呈单链状态。这种由双链RNA-DNA和单链DNA形成的泡状体称R-环结构。二、核酸分子杂交检测法二、核酸杂交检测方法3.R-环检测法缺点：需要电镜！二、核酸分子杂交检测法(二)核酸杂交检测方法4.Northernblotting用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。主要检测插入片段是否被转录。从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。二、核酸分子杂交检测法(二)核酸杂交检测方法5.斑点杂交与Southern杂交和原位杂交相似三、物理检测法利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。(一)凝胶电泳检测法从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。载体重组克隆分子量Marker三、物理检测法(二)酶切电泳筛选法1.原理根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片段，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。三、物理检测法A或B(二)酶切电泳筛选法三、物理检测法(二)酶切电泳筛选法不同克隆的酶切结果三、物理检测法四、免疫化学检测法利用免疫学的原理，检测克隆基因的表达产物。蛋白——蛋白“杂交”利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。(一)放射性抗体检测法1.抗体与产物的结合方式根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为以下几种作用方式：四、免疫化学检测法待测基因产物蛋白一抗二抗125I标记的二抗结合蛋白固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗125I标记的二抗固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗固相支持滤膜固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗二抗125I标记的二抗结合蛋白125I标记的二抗(一)放射性抗体检测法1.抗体与产物的结合方式四、免疫化学检测法(一)放射性抗体检测法2.放射性抗体检测法过程四、免疫化学检测法(一)放射性抗体检测法3.Broome-Gilbert双位点检测法检测融合蛋白。既检测外