血清成分的生化分析.pptVIP

染色电泳完毕后，将膜条取下并放在染色液中浸泡5～10min。漂洗将膜条从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次到无蛋白区底色脱净为止，可得色带清晰的电泳图谱。定量⑴、将膜条用滤纸压平吸干，按区带分段剪开，分别浸在4.0mL0.4mol/L氢氧化钠溶液中半小时，并剪取相同大小的无色带膜条作空白对照，在A650nm进行比色。⑵、将干燥的电泳图谱膜条放在洁净的玻璃板上，将透明液滴入，待膜条完全透明后用吹风机吹干或放入烘箱中烘干，可用光密度计直接测定，此图谱可长期保存。21实验六——（三）凝胶层析（练习实验）目的掌握凝胶过滤层析的技术方法二、凝胶柱层析原理凝胶层析也称凝胶过滤，是一类利用有一定孔径范围的多孔凝胶的层析技术。当样品流经这类凝胶的固定相时，不同分子大小的各组分因进入网孔受阻滞的程度不同而以不同的速度通过层析柱，从而达到分离的目的。12当样品通过层析柱时，分子量较大的物质因为不能或较难通过网孔而进入凝胶颗粒，而是沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动的速度较快，即受阻滞的程度较小，最先流出层析柱；反之，分子量较小的物质，因为颗粒直径小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程较长，向前移动的速度较慢，即受阻滞的程度较大，流出较晚。本实验采用SephandexG-25凝胶柱分离重铬酸钾和蓝葡聚糖混合物。Sephandex：葡聚糖凝胶。G20、G30······G200等，编号越小，筛孔越小。根据需要选取适当型号可分离高分子物质或脱盐等。综合实验二：血清成分的生化分析实验五血清胆固醇的定量测定（4学时）实验六血清蛋白的分离纯化（12学时）实验七血清中转氨酶活力的测定（8学时）实验六01血清清蛋白与γ-球蛋白的分离及鉴定02生命与环境科学学院生化组03总体步骤：盐析→透析→浓缩→电泳（期间穿插凝胶柱层析）盐析50%饱和度，血清球蛋白沉淀α、β、γ-（33%饱和度沉淀）100%饱和度，血清清蛋白沉淀（NH4）2SO4：破坏水膜、中和电荷纯度鉴定：层析（柱）、电泳等01020304二、透析目的：去盐（柱层析也可）透析袋：装样量：1/2～2/3四、电泳目的：鉴定清蛋白和γ-球蛋白纯度三、浓缩目的：去水（蔗糖）五、层析练习：分离蓝葡聚糖和重铬酸钾（蓝色+黄色）实验材料鸡血清：三黄鸡血清或乌骨鸡血清01实验六——（一）02血清清蛋白与γ-球蛋白的盐析、透析与浓缩掌握盐析法分离蛋白质的原理和方法01掌握透析法脱盐及蛋白质浓缩的方法02一、目的试剂及仪器用品血清PBS（NH4）2SO4溶液蔗糖双缩脲试剂酪蛋白BaCl2溶液离心机烧杯移液管透析袋中性盐类能破坏溶液中蛋白分子表面的双电层和水膜，从而使蛋白质从溶液中凝聚沉淀析出。沉淀不同蛋白质所需盐类浓度不同。如，50％饱和的硫酸铵能使血清中的球蛋白沉淀，而33％饱和的硫酸铵则使γ-球蛋白沉淀。因此，可根据所要分离的蛋白质，选择不同饱和度的硫酸铵溶液进行盐析。三、原理透析是利用蛋白质等生物大分子不能通过半透膜的性质的一类纯化方法，可利用该方法分离大分子与小分子的混合物。由于NH4+和SO42-可以通过半透膜，而血清清蛋白不能，因此，可以利用透析的方法使清蛋白溶液脱盐。0102透析装置利用半透膜还可以进行大分子溶液的浓缩。将盛有待浓缩的大分子溶液的透析袋放入高浓度的吸水性强的蔗糖固体颗粒中，袋内溶液中的水被袋外的多聚物所吸收而有效地浓缩。四、实验步骤1、盐析、透析与浓缩离心管2mL血清2mLPBS2mL（NH4）2SO4摇匀静置30′3000rps离心20′上清液（主要含清蛋白）沉淀（主要含γ-球蛋白）3.132g（NH4）2SO4上清液静置30′，离心20′1mL水（或PBS）沉淀流水透析1h蔗糖浓缩清蛋白1mLPBS沉淀1mL水（或PBS）流水透析1h蔗糖浓缩γ-球蛋白滴加0.5mL（NH4）2SO4静置30′，离心20′沉淀（γ-球蛋白）血清清蛋白与γ-球蛋白的鉴定贰实验六——（二）壹—