出口化妆品中病原菌检测方法 微滴式数字PCR法 第8部分：破伤风梭菌.docxVIP

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SN/T5760.8—2024

进出口化妆品中病原菌检测方法微滴式数字PCR法

第8部分：破伤风梭菌

1范围

本文件描述了进出口化妆品中破伤风梭菌的微滴式数字PCR检测方法。本文件适用于进出口化妆品中破伤风梭菌的快速检测。

本文件所能达到的检出限(LODm)为0.58CFU/g(mL)-2.43CFU/g(mL)。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，共最沥版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

SN/T2206.6化妆品微生物检验方法第6部分：破伤风梭菌SN/T5075化妆品微生物检验副样规范

3术语和定义

本文件没有需要得定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

DNA:脱氧核糖核酸(deoxyriboucleicacid)

ddPCR:微滴式数字PCR(dopletdigitalPolymeraseChuinReactiom)

PCR:聚合酶链式反应(PolymenseChainReaction)

5方法原理

针对破伤风梭菌49205染色体上的保守序列设计引物、探针，将一定浓度的引物、探针与模板DNA及反应预混液混合，配成PCR反应体系。将该数字PCR体系分布到12000个-20000个微滴中，使大部分微滴中模板DNA分子的数量为1或0,然后进行PCR扩增。49205染色体基因探针5端标记FAM荧光基团，3°端标记BHQ1。利用数字PCR系统的检测通道，可对每个微滴的荧光信号进行采集分析。含有模板DNA的微滴出现荧光信号的增强，形成阳性微滴簇。最终根据阳性微滴的有无判定样品中是否含有破伤风梭菌。

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样品制备

样品制备

取2mL1:2样品稀释液加入8L应肉培养基

36℃±1℃.厌氧培养-48h~72h

细面NM提取

ddPCR检测

阴性阳性

SN/T2206.6确认

报告

图1进出口化妆品中破伤风梭菌检验程序

9实验操作步骤

9.1样品前处理

待测的样品应在室温下保存，不要温育、冷藏和冷冻样品。样品的制样处理参照SN/T5075的规定执行。

9.2增菌培养

吸取2mL1:2样品稀释液接种到8mi庖肉培养基中，置于36℃±1℃培养箱，厌氧培养48h~72h。

9.3DNA提取

混匀增菌培养物，在其液面表层吸取1mL,于10000g-12000g离心3min,弃去上清液。必要时，用生理盐水清洗沉淀1次-2次。用1mL生理盐水混悬沉淀，于10.000g-12000g离心3min,弃去上清液。在沉淀中加入50μLDNA提取液振荡混匀，于95℃~100℃加热10min,室温冷却2min后，于10000g-12000g离心5min,取上清液作为DNA模板。若不能及时分析，DNA模板可置于-20℃以下冷冻保存备用。

注：若采用商品化DNA提取试剂盒，按其操作说明制备DNA模板。

9.4DNA浓度和纯度测定

样品DNA使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定260nm和280mm处的吸收值Am和Am

圣

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按照公式(1)计算DNA的浓度。

p=Am×Nx50…(1)

式中：

p—DNA浓度，单位为纳克每微升(ng/L);

Am—260mm处的吸光值；N——核酸稀释倍数。

A,/4m在1.8-2.0之间，DNA浓度为0.01n/HL-10ng/HL时，适用ddPCR检测。

9.5ddPCR检测

9.5.1对照和平行

检测过程中分别设置阳性对照、阴性对照和空白对照。以破伤风梭菌标准菌株DNA或含目的片段的DNA作为阳性对照，以非破伤风梭菌DNA作为阴性对照，用等体积的一级水代替模板DNA作

为空白对照。每个待检样品提取的DNA溶液进行3个平行ddPCR检测。

9.5.2反应体系

按照表1配制