杂交瘤技术制备单克隆抗体.pptVIP

在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系时，细胞培养过程中随时可能发生细胞污染，分泌抗体能力丧失等“慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮?“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏12避免染色体丢失22%防止细胞密度过高而死亡40%防止非分泌细胞的过度生长38%防止污染细胞冷冻的意义0401020325%100%50%75%05125%抗体分泌稳定性抗体连续传代法---保持稳定分泌特异性抗体细胞核学特征检查细胞分裂中期染色体---保证不丢失产生抗体基因的染色体鼠源病毒检查细胞试验，动物抗体产生试验，鸡胚感染试验等---排除单抗制品的病毒污染支原体检查荧光染色法，培养法，分子生物学法等—防止污染无菌试验直接接种法，薄膜过滤法杂交瘤细胞检定单克隆抗体的制备01经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。020102动物体内诱生方法：操作简便，经济主要用于生产科研或诊断用单抗腹水浓度可达2-5mg/ml实体瘤法、腹水制备法体外培养法：使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞工艺简单、易控制，可大规模生产浓度不高，200-500ug/ml悬浮培养法、固相培养法单克隆抗体的产生logo腹水制备法***杂交瘤技术制备单克隆抗体抗体部员工培训之——1单克隆抗体（McAb）：3理化性状高度均一2是由只识别单一抗原决定簇的B细胞克隆产生的同源抗体。4效价高5只与一种抗原表位发生反应、生物活性单一6具有高度特异性又易于大量制备如何获得McAb?如何大量获得McAb?需要克服哪些技术问题？01具有合成和分泌抗体的能力02具有大量无限生长的特性理想的抗体分泌细胞：在1975年，Kohler和Milstein将来源于小鼠骨髓的骨髓瘤细胞和啮齿动物可以分泌抗体的细胞融合后形成杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞具有肿瘤细胞无限繁殖的能力，也具有免疫细胞分泌抗体的能力，后来将这种杂交细胞系统统称为杂交瘤（hybridoma）。01通过筛选，分离得到针对特异性抗原并具有所要求的抗体亲和力的杂交瘤细胞。在适当营养条件下，杂交瘤细胞能够生长和无限制性传代，并且能产生大量单一类型的抗体及单克隆抗体。02杂交瘤技术的基本原理单克隆抗体的制备单克隆抗体的应用一杂交瘤技术的基本原理利用聚乙二醇作为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细?胞与具有在体外不断繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一?体，在HAT选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的免疫学检测筛选和单个细胞培养（克隆化）,最终获得既能产生所需单克隆抗体,又能不断繁殖的杂交瘤?细胞系，将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在其产生的腹水中即可得到高效价的单克隆抗体。杂交瘤技术流程免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果1.颗粒性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，可溶性抗原10-50ug/100ul+等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔，2.可溶性抗原冲击免疫（融合前3天进行）选用6-12周龄Balb/c小鼠2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐剂，可反复多次）免疫方案不产生Ig的重链和轻链HGPRT-与提供淋巴细胞的动物品系相同01小鼠骨髓瘤细胞02处于免疫状态脾脏中的B淋巴母细胞或浆母细胞动物：6～12周龄20g～25g体重免疫脾细胞细胞融合剂：PEG:分子量4000的PEG是最常用的细胞融合剂作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合作用特点：不同的分子质量、浓度、作用时间、pH,可能直接影响融合效果细胞融合免疫脾细胞的制备：1-2×108无菌手术04避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞1-2×10705培养骨髓瘤细胞：01浑圆、透亮、均一、排列整齐03对数生长期02常用小鼠腹腔巨噬细胞，5-8×106吞噬衰老细胞和微生物分泌细胞生长因子存活一般不超2周，不影响杂交瘤细胞的纯化饲养细胞：杂交瘤细胞的选择性培养细胞DNA合成途经：1.替代途径：次黄嘌呤（H）HGPRT2.主要途径：氨基酸鸟嘌呤核苷酸谷氨酰胺（A-）尿核苷单磷酸