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分挝SP细胞操作步骤
1、Hoechst33342的配制
储存液，将25mgHoechst33342粉林,加入25ml蒸饮水,制成Imgyml的储存液,零下20度保
存。
工作液，取lm]储存液加入9ml蒸馏水,配制成0.1mgyml的工作波,过滤除菌,4度避光保存.
2、PFI的虑制
储存液:将10mgPI粉末加入10ml蒸饮水.制成Img/ml储存液.专下20度避光保存。
工作液，取lml储存溢,如入49mlPBS,制成20ngpml工作液,过滤除此4虚避光供存,最多可
使用8周
3、分选分成二组，分别为药物组、对照组和维拉帕米组，二组细胞用PBS洗细胞2次，胰
明消化细胞，加入完全培养基，1000r/分钟离心10分钟。然后将其重县于含2锡的胎牛血清
1640由，调整细胞浓度成1X10个/ml，对申组和药物组加入Hoechst33342，调整浓度至5
AgmL，维拉帕米组同时如入维拉帕米100ugmL，避光37度水浴内贱育70分钟，在期
间每15到20分钟震荡一次，最后如入2mL冰磷酸缓冲液(PBS)终止反应，1500rmin
离心10min后痉上清，再用含2%的胎牛血清的PBS洗1次，用2多的胎牛血清的PBS重
慧，PI加入至终浓度1ughnL的，在进行流式细胞分选、鉴定前细胞4度避光保存。
4、流式细胞仪检测分选.350nm(375)波长紫外光激发Hoechst染色,于450/20nm带通下收
集测定蓝光，675nm带通上收集测定红光。选取线性信号,做HoechstRed(X轴)和Hoechst
Blue(Y轴)二维散点图.将HoechstRed及HoechstBlue友信号卫维拉帕米对照组缺失的区域
设定为SP细胞的门,计算训分比.
检测分选参数如下
1激光器:大功率、488nmm紫外激光;2)光电信增管《PMT)光谱检测范围:300一1100nm、
电频:150一990V;3)检测灵敏度:小于200MESF、CV小于1.5锡(2uimBeads)CV小于3名
胃样本获取速度:25000个/秒(细胞N35)分选速度:5000个/秘或以上
名分选纯度:99%7)分选模式:二路采集
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