RNA提取及反转录 .pdf

一、RNA提取

（1）实验材料准备

1.Trizol（全式金，4℃保存）

2.氯仿、异丙醇、无水乙醇（专门用于RNA提取，4℃）

3.75%的乙醇（RPE）：75%无水乙醇+25%DEPC水

4.DEPC水：999mL高压过的三蒸水中加入DEPC（焦碳酸二乙酯）原液1mL，摇匀过夜，4℃

保存。

5.无RNA酶的EP管及枪头（天净沙RNase清除剂购于恩硕公司，天净沙RNase清除剂和单

蒸水以1:1000比例泡5min，倒掉后，再以1:1000比例配比，浸泡过夜，倒掉，以1:10000比

例浸泡3-5min，尽量倒净，高压30min，放烘箱烘干。）

6.移液器、振荡器、高速离心机（最好为4℃离心机）、瞬时离心机、封口膜。

（2）实验步骤

组织样品研磨过程取新鲜采集或保存于-80℃或液氮中的组织200mg（黄豆样大小），放入

盛有1/5液氮的研钵中，先用研杵将组织块敲碎（注意不要让组织和液氮溅出），然后开始研

磨，及时补充液氮以防组织暴露于空气中，将组织研磨成无明显颗粒的粉末状后加入液氮，将

组织液氮混合液倒入预冷的EP管中待液氮挥发完组织还未融化时加入1mLTrizol（或在液氮

即将挥发完毕时，用不锈钢小勺将研磨好的组织加入到盛有1mLTrizol的EP管中），震荡混

匀，-80℃保存备用。

注意事项一定研磨充分，不要求研磨成奶粉状，但至少得看不到明显的颗粒，这样Trizol才

能充分和组织接触，快速裂解组织，也能防止组织的降解（Trizol内含RNA酶抑制剂）。研

磨时注意安全，不要使液氮溅出。

1.取800μLTrizol加入到400μL病毒液（血清、奶汁、稀释处理过的仔猪肠内容物和粪便）

中，振荡器震荡15sec，使其充分混匀，室温静置8min，使得核酸蛋白复合物完全分离。

（超离纯化的病毒，可按原液、1:10、1:50、1:100不同浓度稀释按梯度进行抽提。不同的样品

视情况选择稀释度）

2.可选步骤：4℃12000r/min离心5min，取上清。

注意：如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。

离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组

织样品时，上层是大量油脂，应除去。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。

3.加入160μL氯仿（Trizol体积1/5倍），剧烈振荡15sec，室温放置5min。

注意：如不能旋涡混匀，可手动颠倒混匀2min代替。

4.4℃12000r/min离心10min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和上层无色的水相，

RNA主要在水相中，把水相（约750μL）转移到新的离心管中。（此步骤吸取时注意，宁可

上层水相少吸点也不要吸到中间层）

5.加入等体积的异丙醇（-20度预冷的），混匀，-20℃放置10min。

6.4℃12000r/min离心10min，弃上清。离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧

和管底形成胶状沉淀。

7.加入800μLRPE（75%乙醇+25%DEPC水）洗涤沉淀，将RNA沉淀弹起，漂洗。

注：每使用1mLTrizol至少用1mLRPE对沉淀进行洗涤。

8.4℃12000r/min离心2min，倒出液体，注意不要倒出沉淀，重复两次。空离（12000r/min

离心1min），然后用枪头吸出多余液体。超净台中室温开盖干燥5-10min，使乙醇完全挥发

掉。

9.沉淀用30-50μLDEPC水溶解。分装出10μL，1μL用于RNA检测，7μL用于反转录，其

余-80℃保存。

10.RNA的完整性、纯度、浓度检测

（1）采用NanoDrop公司制造的微量紫外分光光度计,测定RNA样的浓度（OD260）和纯度

（OD260/OD280），纯度要求在1.8-2.0。

（2）琼脂糖凝胶电泳，确定RNA的完整性和污染情况。

注：1、氯仿的作用：一是作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去，同时也通过变

性作用抑制RNase（核糖核酸酶）活性；二是RNA提取试剂中通常含有苯酚（Trizol主要成

分就是苯酚），苯酚微溶于水，抽提完之后水相里有少量的酚，如果不除去会损伤核酸，需要

通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提