分子遗传学第五章.ppt

物理图的绘制原因遗传分析绘制的基因组图为何不能指导基因组计划的测序?为何要绘制物理图?原因有2个遗传图的分辨率有限微生物基因组较小，记录成百上千次重组试验就能获得十分详尽的遗传图，标记分布密度仅为数千核苷酸。人类及大多数高等真核生物由于不可能获得大量的子代，只有少数的减数分裂事件可供研究，连锁分析的分辨力受到很大限制。最好的一份人类遗传图其标记密度平均为599kb，还不能直接用于指导全基因组的测序。离每100kb一个标记的要求仍差距甚远，后者是进入基因组全面测序的前提。高密度基因组图仅仅采用遗传作图技术是无法完成的，必须借助于其他非遗传分析的方法。遗传图的精确性较低Sturtevant的关于交换是随机发生的猜想部分正确，因为重组热点的存在使染色体某一区段的交换频率高于其他区段。特别是倒位区段，由于受到交换限制，无法绘制精细遗传图。遗传图的局限性表明，在进行大规模的DNA测序之前，对大多数真核生物的遗传图必需进行验证并利用其他作图技术予以校正和补充。遗传分析将基因及DNA标记定位在染色体上绘制的遗传图。另一种基因组作图，即直接检测DNA标记在染色体上的实际位置。物理作图技术最有用的方法为以下4类：限制性作图它是将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置。荧光标记原位杂交(FISH)将荧光标记的探针与染色体杂交确定分子标记的所在位置。顺序标签位点(STS)作图通过PCR或分子杂交将小段DNA顺序定位在基因组的DNA区段中。依靠克隆的基因组作图根据克隆的DNA片段之间的重叠顺序构建重叠群，绘制物理连锁图。物理图的绘制方法1、限制性作图2、荧光标记原位杂交3、顺序标签位点(STS)作图1、限制性作图RFLP标记是由限制酶酶切产生的一段DNA片段。不同限制酶识别的顺序各异，大多数限制酶的识别顺序为4、5或6个碱基对，7、8甚至更多的碱基对。（1）、限制性作图的基本原理构建限制图的方法是比较不同限制酶产生的DNA片段的大小。首先用一种限制酶处理样品，经琼脂糖凝胶电泳分离染色后可见大小确定的DNA片段。然后用第二种限制酶处理，获得第二组片段。最后用2种酶混合处理，获得第三组片段。收集所有上述资料进行对比组装，对于2种酶切位点交替出现的区段，利用加减法即可确定酶切位点的相对位置。在连续出现2个或多个相同酶切位点区段，其排列顺序可有多种选择，此时采用部分酶切的办法使该区段只发生一次酶切，然后计算产生片段的长度，选择其中正确的排序。后者称为部分限制作图。部分限制作图可提供完整物理图绘制所需的信息，但是当涉及的限制位点过多时，这种方法就显得力不从心。特别是内部含有大小相同的片段时，位置重叠的片段无法区分，使排序变得非常复杂。此时可采用末端同位素标记结合部分酶解的方法进行物理图绘制。（2）、DNA分子限制性作图如果样品中仅存在较少的限制性位点，用常规的限制酶即可绘制DNA物理图。随着切点数目的增多，单酶切，双酶切及部分酶切产生的条带数成比例扩大，需要对大量的片段进行比对与组装。因为大量片段经琼脂糖凝胶电泳分离时总会有些片段相互贴近，增加了分辨单个条带的困难，很可能遗漏一些片段。限制性作图只能应用于较小的DNA分子，其上限取决于作图分子中限制酶位点的频率。通常采用的6碱基对识别顺序的限制酶仅适合50kb以下DNA分子的精确作图，但50kb远低于细菌及真核生物染色体的长度，只可覆盖少数病毒和细胞器基因组。限制图能否用于大于50kb基因组的作图呢?

稀有切点限制酶限制性内切酶是一类可与DNA结合并在特别的顺序位置切割DNA的酶。因其切割位点有专一性，常用于RFLP分析、限制性作图的操作。有3种限制性内切酶，I型和Ⅲ型对酶切位点的特异性要求不太严格，Ⅱ型限制性内切酶只能在完全正确的顺序切割，专一性很强。例如来自大肠杆菌的限制酶EcoRI的切点总是5’—GAATTC—3，据此可预测已知顺序的DNA经酶切后产生的片段大小及其数目。2500多种限制酶，其中有300多种常用于实验研究。许多限制酶的识别顺序为6碱基对，其他一些识别顺序或长或短，有一些限制酶可识别兼并的碱基顺序，如来自流感嗜血杆菌的限制酶Hinn可识别5’—GANTC—3’,其中N代表4种碱基中任何一种。限制酶切割DNA有2种方式，一种是平端切，即切头无单链突出。另一种可产生粘性末端，即在切口位置留下5’突出或3’突出的核苷酸，一般为4个或2个核苷酸伸出。具有同一粘性末端的片段可以相互匹配，如果加入DNA连接酶将缺口补平，则形成稳定的DNA分子。2个具有平端的DNA片段亦可由连接酶将其彼此结合，但效率较低