大豆品种纯度鉴定技术规程 SSR分子标记法.pdf

NYIT1788-2009

目。

本标准的附录A、附录B为资料性附录。

本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。

本标准负责起草单位：全国农业技术推广服务中心、中国农业科学院作物科学研究所。

本标准主要起草人：廖琴、陈应志、邱丽娟、常汝镇、关荣霞、李春广、王爱瑭。

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NYIT1788-2009

大豆晶种纯度鉴定技术规程SSR分子标记法

1范围

本标准规定了大豆品种纯度的SSR分子标记检测技术规程。

本标准适用于大豆品种纯度鉴定。

2原理

简单重复序列CSSR）分布于大豆整个基因组的不同位置上，不同品种每个位点上重复单位的数目

及序列可能不同，因而形成片段长度多态性。由于每个简单重复序列两端的序列是高度保守的单拷贝

序列，因而可根据其两端的序列设计一对特异引物，利用PCR技术对重复序列进行扩增，扩增产物通过

电泳进行分离，经硝酸银染色，可辨别SSR电泳谱带。通过选用品种间具有广泛多态性的SSR引物，根

据PCR扩增ff物电泳谱带差异（等位变异数目〉，鉴定大豆品种纯度。

3仪器设备、试剂与耗材

参见附录A。

4试剂配制

4.1DNA提取试剂

4.1.10.5mol/LZ二胶四Z酸二锅盐（EDTA)(pHB.O）溶液

称取EDTA186.1g，倒入1000mL烧杯中，加800mL去离子水溶解，用固体氢氧化锅调pH至

8.0，再加去离子水定容至1000mL，混匀，过滤。在4℃条件下保存。

4.l.21mol/L三经甲基氨基甲娱盐酸（Tris-HCI）溶渡（pH8.0)

称取Tris60.55g，倒入500mL烧杯中，加400mL去离子水溶解，用HCl调pH至8.0，再加去离

子水定容至500mL，混匀，4℃条件下保存。

4.1.3DNA提取液

称取氯化纳（NaCl)14.6g，倒入SOOmL烧杯中，加100mL去离子水溶解，加1mol/IJTris-HCl

溶液50ml...，加0.5mol/LEDTA溶液SOmL和sos10g，用去离子水定容至500mL,60℃水溶解，混

匀。4℃条件下保存。

4.1.4三氯甲烧／弄成醇（24+1)

取240mL三氯甲烧和lOmL异戊醇，混匀。

4.2PCR扩增试剂

4.2.1四种脱氯核糖核昔酸（副TPs:dATP、d口P、dGTP、dTIP｝混合溶液配制

取浓度为100mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP储存液各20,uL混合，加入920,uL超纯水，

配成终浓度为2mmol/L工作液。一20℃条件下保存。

4.2.2号l糖1稀释

用超纯水分别配制正向（F）引物和反向（R）引物至浓度均为100,umol/L的储存液，取10µL储存

液加入490,uL超纯水配成2,umol/L工作液。

4.3变性禀丙烯酷肢凝胶电泳试剂

4.3.110×TBE缓冲液

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NY/T1788-2009

分别称取Tris108g，砌酸55g，倒人1OOOmL烧杯中，加入800mL去离子水加热溶解，再加入o.5

mol/LEDTA溶液37mL，混匀，定容至1000mL。

4.3.26%(W/V｝变性聚丙烯酿肢凝胶

分别称取丙烯酷胶57g和甲叉双丙烯股股3g，倒入1OOOmL烧杯中，加入600mL去离子水