聚丙烯酰胺凝胶电泳 (2).ppt

凝胶总浓度T——100ml凝胶溶液中含有Acr和Bis的总克数。T=（a+b）/m×100%T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。C——Bis占单体与交联剂总量的百分比。C=b/（a+b）×100%当T固定时，Bis浓度在5%时孔径最小。第22页,共45页，星期六，2024年，5月3、分类按具体操作分垂直板形电泳圆盘电泳按凝胶系统的均匀性分连续PAGE不连续PAGE第23页,共45页，星期六，2024年，5月电泳体系中所用的缓冲液成分、pH、凝胶浓度相同缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度呈不连续性不连续的凝胶电泳体系对样品的分离效果好，分辨率高，是最常用的体系。电荷效应分子筛效应浓缩效应：不连续性所致连续电泳不连续电泳PAGE电荷效应分子筛效应第24页,共45页，星期六，2024年，5月不连续SDS.原理凝胶的不连续性缓冲离子的不连续性pH的不连续性电位梯度的不连续性分离胶pH8.9浓缩胶pH6.7第25页,共45页，星期六，2024年，5月①凝胶的不连续性：浓缩胶：大孔径。样品在其中浓缩，并按迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上积聚成薄层。分离胶：小孔径。蛋白质分子在大孔胶中受到的阻力小，移动速度快，进入小孔胶时遇到的阻力大，迁移速度减慢。由于凝胶的不连续性，在大孔胶和小孔胶界面处就会使样品浓缩，取带变窄。第26页,共45页，星期六，2024年，5月②缓冲离子的不连续性③pH的不连续性④电位梯度的不连续性制胶缓冲液：Tris-HCl浓缩胶pH6.7分离胶pH8.9电泳缓冲液：Tris-甘氨酸在浓缩胶中，pH环境呈弱酸性，甘氨酸解离少，在电场作用下泳动效率低，而Cl—却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子介于二者之间泳动。第27页,共45页，星期六，2024年，5月由于导电性与电场强度成反比，这一区带形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。样品进入分离胶（pH8.9）后，由于胶中pH的增加，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随Cl-之后，样品不再受离子界面的影响。第28页,共45页，星期六，2024年，5月第29页,共45页，星期六，2024年，5月实验过程凝胶制备样品处理与加样电泳剥胶与固定染色与脱色安装电泳槽第30页,共45页，星期六，2024年，5月实验步骤一、制胶1.配胶配胶应根据所测蛋白质相对分子质量范围选择适宜的分离胶浓度。由于SDS有连续体系和不连续体系两种，两者各有不同缓冲体系，因而有不同的配制方法。（以不连续体系为例）蛋白质的相对分子量的范围分离胶的浓度＜10420%～30%1×104～4×10415%～20%4×104～1×10510%～15%1×105～5×1055%～10%＞5×1052%～5%第31页,共45页，星期六，2024年，5月试剂名称配制20ml不同浓度分离胶所需各种试剂用量/ml配制10ml浓缩胶所需试剂用量5%7.5%10%15%3%分离胶贮液（30%Acr-0.8%Bis)3.335.006.6610.00-分离胶缓冲液（pH8.8Tris-HCl）2.502.502.502.50-浓缩胶贮液（10%Acr-0.5%Bis）----3.0浓缩胶缓冲液（pH6.8Tris-HCl）----1.2510%SDS0.200.200.200.200.101%TEMED2.002.002.002.002.00重蒸馏水11.8710.208.545.204.60混匀后，置真空干燥器中，抽气10min10%AP0.100.100.100.100.05第32页,共45页，星期六，2024年，5月2.分离胶的制备胶灌至距梳子齿下端1cm→灌毕→封上一层水加速聚合→当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。3.浓缩胶的制备用滤纸吸干水→倒入浓缩胶→插入梳子→静置，聚合。第33页,共45页，星期六，2024年，5月二、样品处理与加样1.样品处理2.加样 小心拔出梳子