基因工程近年原文.ppt

基因工程

Geneticengineering

拟探讨的主要内容基本概念基因工程诞生的历史背景基因工程中常用的工具酶基因工程中常用的载体基因工程的基本程序基因工程在医学中的应用基本概念基因重组geneticrecombination不同来源的两个DNA分子在体外进行特异的切割，重新连接，形成新的杂合DNA分子的过程。基因克隆geneticcloning用分离纯化的DNA片段在体外与载体DNA连接，将重组DNA分子导入宿主细胞，经过扩增、筛选鉴定等程序，获得含重组DNA的大量的活细胞。基本概念基因工程geneticengineering将基因进行克隆，并利用克隆的基因表达、制备特定的蛋白质或多肽产物，或定向改造细胞乃至生物个体的特性所用的方法及相关的工作。基因工程诞生的历史背景核酸是遗传物质肺炎球菌转化实验DNA双螺旋模型结构理论的建立中心法则的发现密码子的破译反转录酶的发现质粒的发现限制性内切酶的发现DNA的体外重组基因工程中常用的工具酶核酸限制性内切酶restrictionendonucleases概念：限制性内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。命名原则：1第一个字母（大写、斜体）代表该酶来源的微生物属名；第二、三个字母（小写、斜体)代表微生物种名。2接下来的字母代表微生物的株或型。3如果从一种菌株分离到几种限制性内切酶，则根据发现和分离先后顺序用罗马字母表示。例如：HindⅠHindⅡHindⅢ表示从流感嗜血杆菌（Haemophiliusinfluenzae)Rd株中分离到的几种限制性内切酶。核酸限制性内切酶restrictionendonucleases分类:根据限制性内切酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性分为三类。核酸限制性内切酶restrictionendonucleases核酸限制性内切酶restrictionendonucleasesII型限制性内切酶的功能：核酸限制性内切酶restrictionendonucleases5，AGCT3，3，TCGA5，核酸限制性内切酶restrictionendonucleases几种特殊类型的II型限制性内切酶核酸限制性内切酶restrictionendonucleases限制性内切酶的主要用途制作DNA物理图谱DNA限制性多态性分析基因克隆和亚克隆DNA杂交序列分析基因组同源性研究基因突变和化学修饰的研究核酸限制性内切酶restrictionendonucleases应用限制性内切酶的注意事项-20°C保存缓冲体系为含Mg2+的Tris-Hcl盐酸溶液反应在一般37°C进行（有些在50-65°C）对离子强度要求有高盐，中盐和低盐之分DNA液中不能含酚、氯仿、乙醚、过量的EDTA以及其他盐类避免星号活力DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I由一条109KD的多肽链构成的多功能酶催化反应5，---3，DNA聚合酶的活性3，---5，DNA外切酶的活性5，---3，DNA外切酶的活性DNA聚合酶经枯草蛋白水解酶水解后，产生N-末端（36KD）和C-末端（76KD）两个片段，该大片断为Klenow片段。催化反应5，---3，DNA聚合酶的活性3，---5，DNA外切酶的活性用途双脱氧法DNA测序cDNA第二条链合成修补DNA的3，凹陷末端TaqDNA聚合酶一种耐热的DNA依赖性DNA聚合酶，分子量为65KD，最适作用温度为75-80°C。催化反应5，---3，DNA聚合酶的活性5，---3，DNA外切酶的活性用途聚合酶链反应DNA测序反转录酶一种以RNA为模板反转录生成DNA的酶。催化反应：以ssRNA或ssDNA为模板