碱性磷酸酶基因表达载体的构 建及在大肠杆菌中的表达开题报告.pdfVIP

编号

内蒙古大学生命科学学院生物系

基因工程实验室

本科基因工程实验论文开题报告

论文题目：碱性磷酸酶基因表达载体的构

建及在大肠杆菌中的表达

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年级：2012级

专业：生物技术基地班

指导教师：王郑张立全

2015年7月2日

学生姓名孟祥东民族汉族性别男出生年月1992.7.15

论文题目碱性磷酸酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

开题时间2015年6月18日结题时间2015年6月25日

项目来源本科生基因工程大实验课

一、立论依据

项目的研究意义，国内外研究现状及发展趋势分析，主要参考文献及出处：

碱性磷酸酶（Alkalinephosphamse）是一个非特异性磷酸单酯酶，能催化几乎所有的

磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相对应的醇、酚或糖。碱性磷酸酶既是生物体内一

种重要的调控酶；也是基因工程、临床诊断的一种重要工具酶，已广泛应用于疾病检测、

食品检验、医药生产等领域。本实验通过亚克隆、连接、酶切等不同的技术手段，构建碱

性磷酸酶基因表达载体，在大肠杆菌中得以表达。

这种酶能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成

5’-OH末端。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。目前已发现有APK1、AKP2、AKP3、

AKP4、AKP5和AKP6六种同功酶。

细菌碱性磷酸酶是分子生物学的重要工具酶。在碱性条件下，可以催化磷酸胆脂水解，

生成无机磷酸。在ELISA过程中，BAP常用作标记二抗的酶显色。

近年来，国内外一些学者直接将BAP与抗体蛋白融合表达，避免了酶标二抗的使用和

交叉反应，不仅在疾病诊断中有显著优势，还可以检测与之融合的各种单链抗体的活性。

碱性磷酸酶在酶联免疫等生化检测中有重要作用，是许多生化反应试剂盒的检测酶。目

前国内市场引用的碱性磷酸酶都是从国外进口，并且是有牛、猪肝提取，价格昂贵且产量

不高。从大肠杆菌提取的碱性磷酸酶成本低，热稳定性好，而且能用基因方法实现蛋白质

定向标记等。

参考文献：

[1]赵赣，钱芳，孙永学，等.鸡肝碱性磷酸酶的分离纯化及其部分性质的研究[J].

上海交通大学学报，2003，21（3）：194-198.

[2]刘晓雯，刘克武，闵丽娥，等.黑眉锦蛇小肠碱性磷酸酶的分离纯化及其部分

性质研究[J].四川大学学报，2001，38（5）：732-736.

[3]谢莉萍，林静瑜，肖锐，等.合浦球母贝碱性磷酸酶的分离纯化与性质研究[J].

海洋科学，2000，24（10）：37-40.

[4]唐云明.泥鳅碱性磷酸酶的分离纯化及其部分性质[J].水产学报，1997，21（3）：

336-339.

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二、实验方案

1．实验内容和实验目标，拟解决的关键问题：

实验内容：利用基因工程实验技术操作碱性磷酸激酶基因，将已连接在Pmd19-t载体上的

碱性磷酸激酶酶源基因用PCR扩增出837bp的纳豆激酶的基因片段，与T载体连接后导

入感受态的DH5Aα菌种筛选鉴定。用双酶切切下纳豆激酶的成熟基因片段，插入带有6

个组氨酸标签的原核载体pET-his,导入BL（21）DE3感受态菌种诱导表达纳豆激酶蛋白质，

用SDS鉴定。

优化质粒DNA碱裂的方法、DNA琼脂糖凝胶电泳技术、PCR操作技术、大肠杆菌

感受态的制备、目的菌种的筛选