《转基因玉米实时荧光定量PCR检测操作技术规程》.docxVIP

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DB21/XXXXX—XXXX

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ICS?65.020.20

CCSB05

FORMTEXT?????

DB21

FORMTEXT辽宁省地方标准

DB21/TXXXX—xxxx

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转基因玉米实时荧光定量PCR检测操作技术规程

Technicalspecificationforreal-timePCRdetectionoftransgeniccorn

（征求意见稿）

xxxx-x-x发布

xxxx-x-x实施

FORMTEXT辽宁省市场监督管理局???发布

DB21/T—2024

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前??言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口。

本文件起草单位：辽宁省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所。

本文件主要起草人：李会、任志莹、陈芳芳、王颖、郭春景、王建忠、刘万国、王在亮。

本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。

归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024

文件起草单位通讯地址：辽宁省农业科学院（沈阳市沈河区东陵路84号），联系电话：024

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转基因玉米实时荧光定量PCR检测操作技术规程

1范围

本文件规定了转基因成分检测中使用实时荧光定量方法进行转基因玉米含量的绝对定量检测时试剂选择、体系配制、标准曲线设置、转基因品系百分含量计算等技术要求。

本文件适用于转基因玉米转基因含量绝对定量的操作。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

农业部2259号公告-5-2015转基因植物及其产品成分检测实时荧光定量PCR方法制定指南

农业部2031号公告-19-2013转基因植物及其产品成分检测抽样

农业部1485号公告-4-2010转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文本

3.1

玉米转化体event-specificofMaize

外源DNA插入玉米作物基因组后经重组产生的邻接区序列，也称为品系特异性。

3.2

内标准基因endogenousreferencegene

在检测物种中拷贝数恒定的、不显示等位基因变化的基因。该基因可用于判定物种特异性。

3.3

荧光定量探针型试剂qPCRMasterMix(Probe)

试剂公司生产销售，专门用于Taqman探针方法的荧光定量PCR试剂。

4方法和原理

采用规定的引物和探针对试样中玉米内标准基因和转化体特异性序列进行实时荧光PCR扩增，依据是否获得预期的典型扩增曲线，判断样品中是否含有转化体成分。根据标准曲线样品模板拷贝数对数与Ct值间的线性关系，分别绘制转化体特异性序列和玉米内标准基因的标准曲线，计算试样中转化体特异性序列和玉米内标准基因的拷贝数及其比值，获得样品中转化体的含量。

5仪器设备和试剂

5.1主要仪器

5.1.1分析天平：感量0.1g

5.1.2实时荧光PCR仪

5.1.3超微量分光光度计

5.2试剂

5.2.1DNA提取试剂盒

5.2.2荧光定量PCR试剂，采用探针型试剂

5.2.3PCR级无菌水

6.操作步骤

6.1抽样

按农业部2031号公告-19-2013转基因植物及其产品成分检测抽样。

6.2样品制备

农业部1485号公告-4-2010转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化。

6.3DNA模板制备

农业部1485号公告-4-2010转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化。

6.4标准品DNA模板制备

6.4.1采用相同的标准样品同时制备转化体和内标准基因的标准曲线。

6.4.2样品中植物基因组拷贝数=样品DNA质量（g）×6.02×1023/（植物单倍体基因组的大小×324.5×2），玉米基因组拷贝数为2319MbpCopies/μL，由此计算出1ng的纯合体玉米基因组DNA约含有400个拷贝的目标PCR产物片段。DNA浓度与拷贝数的对应关系见附录A。

6.4.3将标准品稀释至合适浓度，使其梯度稀释后满足标准曲线梯度需求。

6.5标准曲线的制备

6.5.1