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脂肪干细胞的提取及鉴定(1)--第1页

红色的是参考同类实验所用的方法，比例，不知道在我们实验室可行不，黄色是

疑问的地方，希望老师解答下谢谢

一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定

1、实验技术及原理：运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后ACSs的表

型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术

（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括

血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，

基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最

终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。取C57BL／6WT小鼠2只，

常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，

0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶

的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM

重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，

得到单个核细胞。镜下计数，按10个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO

⒋孵

2

箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25%

Trypsin,0.02%EDTA消化传代。细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细

胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（CD29/CD44）的鉴定。

2、实验用品：

2.1材料：C57BL／6WT小鼠

2.2试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM

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2.3仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、

离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网

过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗

3、细胞培养的方法与步骤：

3.1无菌操作的要领和要求。（前两周重点学习）

3.2细胞原代培养：

3.2.1操作步骤

a．培养用品消毒后，安防在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。

b.取材：取C57BL／6WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至

糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。

c.消化：将漂洗后的组织至于平皿中,加入胶原酶（0.075%II型胶原酶,PH），

用量（0.1-0.3ug/ml或200U/ml），再用移液管移至烧瓶中，置于37℃水浴或恒

温箱中30分钟），每隔5-10min振荡一次。30min后，生理盐水终止胶原酶的

消化。

d.离心和计数：将离心管做好标记，平衡后以（1200g,1200r/min？10分钟），

去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨

溶解剩余红细胞，将收集的细胞悬液经200目铜网过滤，1200r/min？离心10分

钟（先后顺序），得到单个核细胞。加入培养液吹打混匀后取样计数。根据计数

结果调整细胞浓度为10个细胞/ml。

⒋

e．接种培养：每10cm2的培养瓶接种1ml的细胞悬液，再添加4ml的