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Westernblot中膜的选择及其特点

PVDF市场上出售的一般有俩种：0.45μm孔径和0.2μm孔径，

作用原理是疏水作用导致其强的蛋白质吸附性，一般来说均一的

0.45μm孔径特别适合于20kD的蛋白质转印，0.2μm孔径适合20kD

的蛋白质转印。

0.2μm孔径的PVDF膜吸附量会比较大，从而会导致背景很高！

解决办法：用封闭液的时候加倍，时间加倍！不行就三倍！可以降低

背景！

解释：

封闭:1、原先我们用脱脂奶粉封闭的浓度是0.5%,为了减低背景,需要

把封闭液的浓度加倍到1%,如果效果还是不好可以加倍到1.5%.

2、时间也要加倍，比如说，原先一小时，现在用两个小时。

为什么用0.2um的膜背景会很高,是因为蛋白的结合和膜的表面积有

关,0.2um的膜显然要比0.45um的膜的内表面积大.所以我们在封闭

的时候要加大封闭的量和时间,要尽量完全封闭.

NC膜PVDF膜尼龙膜的特点

解答：尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型;硝酸纤维素

膜(NC膜)是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜;PVDF膜介

于二者之间。

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就结合能力而言：尼龙膜结合DNA和RNA能力可达

480-600mu;g/cm2，可结合短至10bp的核酸片段;硝酸纤维素膜(NC

膜)结合DNA和RNA能力可达80-100mu;g/cm2，对于200bp的核酸

片段结合能力不强;PVDF膜结合DNA和RNA能力可达

125-300mu;g/cm2。

就温度适应性而言：尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧

啶碱基可与膜上的正电荷结合;硝酸纤维素膜(NC膜)依靠疏水性相互

作用结合DNA，结合不牢固;PVDF膜结合牢固，耐高温，特别适合于

蛋白印迹。

就韧性而言：尼龙膜较强;硝酸纤维素膜较脆，易破碎;PVDF膜较强。

就重复性而言：尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可

经碱变性被洗脱下来;硝酸纤维素膜(NC膜)不能重复使用;PVDF膜可

以重复使用。

WesternBlot时该选择NC膜还是PVDF膜?

硝酸纤维素膜：硝酸纤维素膜(NC膜)是蛋白印迹实验的标准固相支持

物。在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与

硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，虽然这其中的

机制还不是十分清楚，但由于硝酸纤维素膜(NC膜)的这个特性，而且

易于封闭非特异性结合，从而得到了广泛的应用。在非离子型的去污

剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量

大小，要选择不同孔径的硝酸纤维素膜(NC膜)。因为随着膜孔径的

不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。但是膜孔径如果小于

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0.1mm，蛋白的转移就很难进行了。因此，我们通常用0.45mu;m

和0.2mu;m两种规格的硝酸纤维素膜。大于20kD的蛋白就可以用

0.45mu;m的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2mu;m的膜了，如果

用0.45mu;m的膜就会发生“Blowthrough”的现象。从膜的质地上

来看，最重要的指标就是单位面积上