蛋白质提取与纯化技术总结.pdfVIP

蛋白质提取与纯化技术总结--第1页

蛋白质提取与纯化技术总结

蛋白质提取与纯化技术

1.蛋白质（包括酶）的提取

大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的

蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂

提取分离和纯化蛋白质及酶。

水溶液提取法：稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度

大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，

提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效

成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，

因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使

蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用

低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入

蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。

下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。

1、pH值

蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏

离等电点两侧的pH范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过

碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆

变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质

用偏碱性的提取液。

2、盐浓度

蛋白质提取与纯化技术总结--第1页

蛋白质提取与纯化技术总结--第2页

稀浓度可促进蛋白质的溶解，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子

与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液

中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液

常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。

有机溶剂提取法：一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多

的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙

酮和丁等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是

理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁提取法对提取一

些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁亲脂性强，特

别是溶解磷脂的能力强；二是丁兼具亲水性，在溶解度范围内（度为

10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁提取法的pH

及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。

2.蛋白质的分离纯化

亲和层析法：

亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等

特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力。正如

在酶与底物的反应中，特异的废物（S）才能和一定的酶（E）结合，

产生复合物（E－S）一样。在亲和层析中是特异的配体才能和一定

的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。而亲和层析与酶一底

物反应不同的是，前者进行反应时，配体（类似底物）是固相存在；

后者进行反应时，底物呈液相存在。实质上亲和层析是把具有识别能

力的配体L（对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等）以共价

蛋白质提取与纯化技术总结--第2页

蛋白质提取与纯化技术总结--第3页

键的方式固化到含有活化基团的基质M（如活化琼脂糖等）上，制成

亲和吸附剂M－L，或者叫做固相载体。而固化后的配体仍保持束缚

特异物质的能力。因此，当把围相载体装人小层析柱（几毫升到几十

毫升床体积）后，让欲分离的样品液通过该柱。这时样品中对配体有

亲和力的物质S就可借助静电引力、范，以

及结构互补效应等作用吸附到固相载体上，而无亲和力或非特异吸附

的物质则被起始缓冲液洗涤出来，并形成了第一个层析峰。然后，恰

当地改变起始缓冲液的PH值、或增加离子强度、或加人抑③剂等因

子，