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*如果采用底部加热的方式，将会造成管内液体的蒸发，严重影响反应体系的准确性！一般说来，基因片段的长度为750bp左右时，通常可按下列条件进行PCR：*1.琼脂糖凝胶电泳原理在pH8.0的电泳环境中，DNA分子由于含有大量的磷酸基团而带负电荷。因此，在一定强度的电场中，带负电荷的DNA会从负极向正极迁移。用于制备电泳凝胶的琼脂糖是一种线性多糖聚合物，煮沸冷却后形成样结构，电泳中起分子筛作用。通常情况下，分子量大的DNA电泳过程中由于受到凝胶网格的阻力较大，泳动速率较慢;反之，分子量较小的DNA片段在琼脂糖网格中收受到的阻力较小，因此泳动速率较快,跑在前面。*实验二、RNA提取及RT-PCR实验内容1、小鼠肝脏组织总RNA的提取2、RNA的琼脂糖凝胶电泳3、以RNA为模板进行RT-PCR4.PCR产物的电泳及回收实验一.提取小鼠肝脏组织的RNA一、真核细胞的总RNA1、mRNA:1-5%5`鸟嘌呤7位甲基化—CH3修饰。1）免受核酸酶破坏，2）起始、促进蛋白质合成。3`poly(A)尾巴结构20--200个A.翻译所必需。起始密码：AUG终止密码：UAA,UAG,UGA。2、tRNA:10-15%3.rRNA:80-85%大亚基60S:28S=4718nt5S=120nt5.8S=160nt小亚基40S:18S=1874nt二、RNA提取的注意事项RNA酶：广泛存在：灰尘、人体唾液、实验器材表面。生物活性非常稳定：耐热、耐酸、耐碱。1、尽量避免外源性RNase污染A.操作环境空气洁净。带手套、口罩。B.用新开封的化学试剂。（试剂应该专用）C.一次性塑料器材最好是新开封，(DEPC水处理后）高压灭菌。D.玻璃器材、水都应该经过去RNase处理。对玻璃器材还应该进行高温烘烤。2.抑制内源性RNase活性：RNase抑制剂。RNA分离的关键因素:避免RNA酶的污染。1)发放口罩,帽子,每个组来一个人领取。将1mLTrizol试剂移入Eppendorf管中。2)实验教师操作:取新鲜小鼠肝脏组织,组织块不宜过大,放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。3)将研磨后的组织(小米粒大小)转移至1mLTrizol试剂中,盖紧盖,上下颠倒混合2min以上。
使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。4)室温孵育10min。三、RNA提取的实验操作播放有声课件1:RNA提取方法及注意事项1、异硫氰酸胍法：GuSCN是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性Rnase的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总RNA。特点：需低温操作，但价格经济。2、Trizol试剂（商品化产品）特点：在室温下可以提取细胞总RNA，简单、快速、提取量大、纯度高。3.mRNA提取试剂盒真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。RNA提取的几种方法室温孵育10min介绍RNase抑制剂1、DEPC(二乙基焦炭酸盐)最常用的RNase抑制剂:与蛋白质中的组氨酸结合，
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