RT-PCR反转录原理及方法.pptVIP

精选2021版课件*RT-PCR原理及方法09-10-15精选2021版课件*背景基因的表达基因组DNA(genomicDNA)信使RNA(messengerRNA,mRNA)蛋白质产物不同细胞或组织表达不同的基因精选2021版课件*目的通过反转录(reversetranscription,RT)和聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)的方法,检测目的基因在特定组织或细胞中、mRNA水平的表达丰度。精选2021版课件*原理及方法mRNA(messengerRNA)cDNA(complementaryDNA)PCR产物RT(反转录)PCR(聚合酶链反应)精选2021版课件*原理及方法精选2021版课件*精选2021版课件*步骤1--提取总RNATRIzol法抽提总RNA

1、细胞1×107或组织100mg,加1mlTRIzol

(细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块匀浆要彻底，后转至EP管）

颠倒混匀10下，室温5分钟。

2、氯仿1/5体积（0.2ml），颠倒混匀10下，室温5分钟。

3、4℃，离心12000g，15分钟。

4、转上层水相（约400μl）于另一1.5mlEP管中，加等体积异丙醇（约400μl），混匀室温10分钟。

5、4℃，离心12000g，10分钟。6.弃上清，加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml。

7、4℃离心7500g，5分钟。

8、弃上清，空气干燥5-10分钟（不能完全干燥），溶于DEPC水中至20μl

（可在55-60℃水中，10分钟助溶）。9、紫外分光光度计测总RNA浓度。精选2021版课件*步骤2—反转录(RT)逆转录反应：1、试剂浓度体积终浓度

RNA23μl(11.5μl)

Oligo(dT)150.05μg/μl4μl(2μl)0.005μg/μl

混匀，离心，70℃5min。2、立即冰水浴，稍离心

试剂浓度体积终浓度

M-MLVBuffer5×8μl(4μl)1×

dNTP10mM2μl(1μl)0.5mM

RNasin40U/μl1μl(0.5μl)20μ

M-MLV200U/μl2μl(1μl)200U

总体积40μl（20μl）混匀，离心，42℃60-90min。3.95℃10min（破坏MLV），4℃保存。

精选2021版课件*步骤3—聚合酶链反应(PCR)PCR反应:反应体系:总体积20μl(50μl)

试剂浓度体积终浓度

TaqBuffer10×2μl(5μl_)1×

dNTP10mM0.2μl(0.5μl)200uM

上游引物10pmol/μl0.3μl(1μl)10pmol

下游引物10pmol/μl0.3μl(1μl)10pmol

cDNA模板(1-10μl)

Taq酶2.5U/μl0.3μl(1μl)2.5U/μl

DEPC水20μl-4.3μl

混匀

反应条件:95℃5分预变性

94℃30秒变性

X℃40秒退火

72℃30秒延伸

72℃7分终末延伸

28-36循环，4℃保温

精选2021版课件*步骤4—琼脂糖凝胶电泳加1-10μlPCR产物与上样缓冲液（1-2.5μl）混匀,加样,电泳。精选2021版课件*所需材料及试剂一、实验器具与材料：

1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl

2、吸头：1ml、200μl、20μl

3、匀浆管：5ml

4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个

5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl

6.试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）

1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）

7、量筒：50ml、250ml、500ml