mtt原理步骤结果分析方法及注意事项.pdfVIP

MTT原理

MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，汉

语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜

色的。

MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸

脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死

细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处

测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数

成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗药物筛选、细胞毒

性试验以及敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。

缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作

量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的对实验者也有损害。

MTT溶液的配制方法

通常，此法中的MTT浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT0.5克，溶于100ml的磷酸缓冲液

（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即

可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。实验的时候我一般关闭超净台上的日光

灯来避光，觉得这样比较好。

需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对，但不能测定细胞绝对数。在用酶

标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT吸光度最好在0-0.7范围内。

MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度

长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。

我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么

多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。

MTT有性，用的时候,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，

MTT对菌很敏感；往96加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以

把操作台上的照明灯关掉.

配制MTT时用PBS（ph=7.4）溶解。PBS配方：Nacl8g＋Kcl0.2g＋NaHPO1.44g

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＋KHPO0.24g调pH7.4,定容1L。

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普通MTT法实验步骤：

1：接种细胞：用含10％胎小牛得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细

胞接种到96，每孔体积200ul.

2:培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。

3：呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul.继续孵育4

h，

终止培养，吸弃培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃培养上清液。

每孔加150ulDMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。

4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为

横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

药物MTT法实验步骤

贴壁细胞：

1:收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度1000-

10000孔，（边缘无菌PBS填充）。

2:5%CO，37℃孵育，至细胞单层铺满（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，

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细胞贴壁后