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常常⽤⽤分分⼦⼦⽣⽣物物学学实实验验技技术术--整整理理

常⽤的分⼦⽣物学实验技术：

离离⼼⼼技技术术：：

是分离纯化蛋⽩质、酶、核酸（DNA、RNA）、细的最常⽤⽅法之⼀。

电电泳泳（（electrophoresis））：：带带电电粒粒⼦⼦在在电电场场中中向向着着与与其其所所带带电电荷荷相相反反⽅⽅向向电电极极移移动动的的现现象象。。

可⽤于分离不同分⼦量的⽣物⼤分⼦。

1.蛋⽩质的电泳：

⽤途：蛋⽩质的定量。

2.核酸的电泳：

⽤途：⽤于核酸的分离、鉴定、纯化、回收。

⽐如：我只需要长度300bp左右的分⼦。那么，电泳后，在切胶过程中，只切300bp处的分⼦即可。

蛋蛋⽩⽩质质研研究究相相关关的的技技术术：：

1.含量测定：

2.结构的测定：

（1）⼀级结构的测定：搞清楚蛋⽩质肽链的氨基酸排列顺序。

⽅法：Edman降解法、质谱法（MS,将蛋⽩⽔解，多肽链分成⼩段。检测肽段）

（2）空间结构测定：蛋⽩空间结构分析⽐⼀级结构分析复杂得多。

⽅法：X射线衍射晶体分析法、核磁共振法等。

3.功能的测定：

（1）酵母双杂交（YTH）：

假设：欲检测蛋⽩X与蛋⽩Y是否相互作⽤。

检测⽅法：

将蛋⽩X与报告基因转录因⼦的BD融合；

将蛋⽩Y与AD融合；

确认蛋⽩X与蛋⽩Y形成的复合体能否激活报告基因的表达。如果能激活报告基因的表达，说明：X与Y形成了复合体，则

BD和AD靠近，激活了下游报告基因的表达；反之，报告基因不表达。

原理：

真核⽣物的转录因⼦（尤其是酵母转录因⼦GAL4），包括两个彼此分离、但功能必需的结构域：⼀个是与DNA结合的结

构域-BD；⼀个是转录激活域-AD。BD识别转录因⼦效应基因的上游序列并与之结合；AD通过与转录复合体的其他成分作⽤，启动下游的

基因转录。

即使BD与AD分开，但如果在空间上较为接近时也能激活转录。——利⽤转录因⼦的BD、AD这⼀特性，通过检测转录因

⼦是否启动了其效应基因的表达，可研究蛋⽩质X与Y是否相互作⽤。

（2）蛋⽩质芯⽚技术：⼀种⾼通量、微型化、⾃动化的蛋⽩质分析技术。⼀次试验中可同时检测⼏百甚⾄⼏千种⽬标蛋⽩或多

肽。

（3）免疫印迹技术Wstrnblotting：利⽤抗原抗体特异反应的原理。

⽤途：检测样品中特定蛋⽩质是否存在以及半定量分析、研究蛋⽩质间的相互作⽤。

（4）免疫共沉定技术（co-immunoprcipitation，Co-IP）

（5）GSTpull-down技术

（6）⽣物信息学预测蛋⽩质

核核酸酸分分⼦⼦杂杂交交（（nucleicacidhybridization））：：指指来来源源不不同同但但具具有有⼀⼀定定同同源源性性的的核核酸酸分分⼦⼦变变性性后后，，在在⼀⼀定定条条

件件下下复复性性时时单单链链之之间间相相互互配配对对，，形形成成杂杂化化双双链链的的过过程程。。

在实际操作中，常使⽤标记过的已知序列的特定核苷酸⽚段（即核酸探针）与待测样品进⾏杂交，以确定特定核酸序列是否存在。

核酸探针（prob），根据其性质和来源，基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和⼈⼯合成的寡核苷酸探针。

（1）基因组DNA探针：制备简单、不易降解、标记⽅法成熟，是最常⽤的探针。

（2）cDNA探针：以mRNA为模板，在反转录酶的催化下合成的DNA分⼦。

cDNA探针均为编码序列，不存在内含⼦和⾼度重复序列，在探查某些基因的差异表达⽅⾯应⽤较多。

（3）RNA探针：是⼀段标记过的RNA分⼦，⽤于探测与之互补的DNA或mRNA链。

RNA探针在杂交效率、观察基因的正反向转录状况、反义核酸研究等⽅⾯有着明显优势。

（4）⼈⼯合成的寡核苷酸探针：如果只知道蛋⽩质的氨基酸排列顺序，⽽不知其编码基因的碱基顺序，可以利⽤⼈⼯合成的寡核

苷酸探针来探查未知基因的序列。

核酸分⼦杂交的类型：

（1）Southrn印迹杂交：将电泳分离的待测DNA⽚段转移并结合到⼀定的固相⽀持物上，并与标记过的DNA探针进⾏杂交检测的