脓汁和粪便标本中病原菌的检测-4.pptVIP

器材准备染色瓶6组，染色架8个。医学微生物学实验

综合性实验一脓汁和粪便标本中病原菌的检测（四）斜面培养物的观察革兰染色法肉汤接种法半固体接种法显微镜油镜的使用斜面培养物的观察从普通平板上挑取的金黄色或白色菌落接种的斜面，菌苔的颜色，还是原来菌落的颜色，金黄色或白色。从伊红美蓝平板上挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面，菌苔已经没有原来菌落的颜色。菌苔灰白色、表面湿润、光滑、不透明或半透明。为了讲解方便，以后的实验，仍然沿用初次分离得到菌落的颜色—紫黑或粉红。从斜面上取菌时，一般只取半个小菌落大小的菌量；接种环或接种针在菌苔上轻刮一下即可。脓汁和粪便标本中病原菌的检测实验流程①培养基的制备②细菌的分离培养③细菌的纯培养④细菌的形态学检查⑤细菌的生化试验等⑥细菌的血清学试验、结果分析→实验论文撰写细菌染色法单染色法：只用一种染料染色，能清楚观察菌体大小、形态与排列，不能鉴别细菌。复染色法（鉴别染色）：采用两种以上的不同染料进行先后染色，可将细菌染成不同的颜色，以便鉴别细菌。抗酸染色:用于检查结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌等抗酸性细菌(※一些一旦用某些方法染色后，能够抵抗酸性酒精脱色的细菌)，阳性者为红色。特殊染色：荚膜染色，芽胞染色，鞭毛染色，极体染色（用于白喉杆菌异染颗粒染色）。结核分枝杆菌抗酸染色麻风分枝杆菌抗酸染色产气荚膜梭菌荚膜Hiss染色破伤风梭菌芽胞芽胞染色变形杆菌鞭毛Leifson染色白喉棒状杆菌异染颗粒Albert染色革兰染色法GramStaining革兰染色法是丹麦内科医生ChristainGram于1884年创立的一种细菌染色方法，已有130多年的历史，仍在广泛使用。革兰染色法原理的三种学说通透性学说：G+菌细胞壁结构比较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，酒精不易透入，反而可使细胞壁脱水而形成一道屏障，阻止染料向细胞外渗。G-菌细胞壁比较疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质，易被酒精溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫—碘复合物容易被酒精脱出。等电学说：G+菌等电点(pH2～3)比G-菌(pH4～5)低，一般染色时染液的酸碱度在pH7.0左右，电离后阳性菌带的负电荷比阴性菌多，因此与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。化学学说：G+菌细胞内含有某种特殊化学成分，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它与染料—媒染剂复合物结合，使已着色的细菌不易脱色。革兰染色的意义鉴别细菌：把细菌分成G+和G-两大类。选择抗菌药物：例如G+球菌对青霉素敏感,G-杆菌耐药。了解细菌的致病机理：G+菌大多产生外毒素,G-菌产生内毒素。革兰染色的步骤涂片→干燥→固定→染色涂片的制备PrepareaSmear甲→金黄，紫黑。乙→白色，粉红。丙→金黄，紫黑。丁、戊→白色，粉红。↑细菌合适↑细菌较多①接种环取盐水3ul×2滴,水滴间距小于2cm。②取菌苔少许（1mm小菌落半个）与盐水混匀，涂成大于1cm2均匀涂膜。③涂毕→环移至涂膜中央侧立，待环内菌膜破裂，接种环烧灼灭菌。固定Fixation涂片smear干燥dry①手持载玻片一端，涂膜朝上，两个涂膜快速通过火焰外层3次，时间2～3秒钟。②促使菌体蛋白质凝固，固定在载玻片上，以免染色水洗的时候，细菌被水洗掉。革兰染色方法步骤TheGramStainProcedure涂片→干燥→固定→↓结晶紫→初染1分钟→水洗→↓卢戈氏碘液→媒染1分钟→水洗→↓95％乙醇→脱色约20秒钟→水洗→↓稀释品红→复染1分钟→水洗→↓吸干,镜检。★取菌适量,涂片均匀,水洗轻缓,脱色适当。★影响革兰染色的关键步骤是涂片和脱色。革兰阳性菌Gram-Positive革兰阴性菌Gram-Negative镜检光学显微镜革兰染色╳1000G+链球菌G-双球菌G+杆菌G+短杆菌G-弧菌G-螺菌液体培养基接种法Inoculationofliquidmedium甲→金黄,乙→白色,丙→紫黑,丁、戊→粉红。标记：组号，颜色37℃培养4小时4～5×108cfu/ml①接种环斜面取菌，在靠近培养基液面管壁上，上下研磨接种。②在管壁上，将接种环内的菌膜拍破。退出接种环，烧灼灭菌。半固体穿刺接种法

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