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生化技术原理与应用

第一章：生物大分子的提取和别离

第一节生物大分子的提取

蛋白质〔包括酶〕，核酸，脂类，糖类等生物大分子的制备分四个阶段：一、选择材料和预处理。二、细胞的破碎及细胞组分的别离。三、提取和纯化。四、浓缩，枯燥和保存

一、选择材料及预处理

动物，植物，微生物都可作为制备生物大分子的原材料，所选用的材料主要依据试验目的来确定。

有效成份是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。而有效成分以外的其它物质那么统称杂质。

材料选择应遵循的原那么是：有效成分含量多、稳定性好；来源丰富、保持新鲜；提取工艺简单、有综合利用价值等。

二、确定测定方法

在效成分在原材料中含量较低，纯化是使其纯度增高的过程，因此，提取和别离的每个步骤均要测定有效成分的含量。

测定方法要专一、准确、灵敏和简便。

使用较多的测定方法有分光光度法、荧光分析法、生物活性(如酶活力、激素活性)测定、电泳分析等，有时可用电化学法和免疫分析法。

三、细胞破碎技术

细胞破碎方法及其原理：

酶解法的特点

优点：

1、发生酶解的条件温和

2、能选择性地释放产物

3、胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整

选择性释放目标产物的一般原那么

缺点：

1、溶酶价格高，

2、溶酶法通用性差〔不同菌种需选择不同的酶)

3、产物抑制的存在。

仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围

1、当目标产物存在于细胞膜附近时，可采用较混和的方法，如酶溶法、渗透压冲击法和冻结－融化法等。当目标产物存在于细胞质内时，那么需采用强烈的机械破碎法．

2、当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调节溶液pH值，离子强度或添加与目标产物具有亲和性的试剂如：螯合剂、外表活性剂等，使目标产物容易溶解释放。

(2)机械破碎法和化学法并用可使操作条件更加温和，在相同的目标产物释放率条件下，降低细胞的破碎程度。

四.抽提

1.抽提的含义：

抽提通常是指用适当的溶剂和方法从原材料中把有效成分别离出来的过程。

经过处理的原材料中的有效成分可用缓冲液、稀酸、稀碱、或有机溶剂〔如丙酮、乙醇〕等抽提，有时还可用蒸馏水抽提。

一般理想的抽提液应具备下述条件：对有效成分溶解度大，破坏作用小；对杂质不溶解或溶解度很小；来源广泛、价格低廉、操作平安等。

2.抽提的影响因子

在抽提阶段，pH值、金属离子、溶剂的浓度和极性等因子，可明显影响有效成分的性质和数量。因此选择抽提液必须考虑这些因素。

〔1〕pH值：

改变溶质解离状态。

对蛋白质或酶等具有等电点的两性电解质物质，一般选择抽提液的pH值应在偏离等电点的稳定范围内。通常碱性蛋白质选用低pH值的溶液抽提，酸性蛋白质选用高pH值的溶液抽提，或者用调至一定pH值的有机溶剂抽提。

注意：当用酸，碱控制溶液pH值时，要边加边搅，防止局部出现过高的酸，碱浓度造成蛋白变性。

(2)溶剂的极性和离子强度：

有些生物大分子在极性大、离子强度高的溶液中稳定；有些那么在极性小、离子强度低的溶液中稳定。例如提取刀豆球蛋白A时，用0.15mol/L甚至更高浓度的NaCl溶液，都可使其从刀豆粉中溶解出来，稳定存在。而抽提脾磷酸二酯酶时，那么需用0.2mol/L蔗糖水溶液。

一种物质溶解度大小与溶剂性质密切相关〔相似相溶原理〕；离子强度通过影响溶质的带电性也影响溶质的溶解度。

降低极性：在水溶液中加蔗糖，甘油，二甲亚砜，二甲基甲酰氨。

提高离子强度：在水溶液中加中性盐〔KCl,NaCl,NH4Cl,(NH4)2SO4〕

一般离子强度较低的中性盐溶液可促进蛋白溶解〔盐溶〕，高离子强度的中性盐可引起蛋白质沉淀，析出〔盐析〕。

高离子强度使DNA溶解度增加；低离子强度使RNA溶解度增加〔核酸别离依据〕。

常用的盐溶液是NaCl溶液，浓度以0.15mol/L为宜。但是在提取核蛋白或细胞器中的蛋白质时，为促使蛋白质与核酸、蛋白质与细胞器别离，那么宜用高浓度(0.5-2.0mol/L)的盐溶液。

(3)水解酶：

细胞破裂后，许多水解酶释放出来。水解酶与欲抽提的蛋白质或核酸接触时，一旦条件适宜，就会发生反响，导致蛋白质或核酸分解，而使实验失败。为此，必须采用参加抑制剂，调节抽提液的pH、离子浓度或极性等方法，使这些酶丧失活性。

(4)温度：

一般认为蛋白质或酶制品在低温(如0℃左右)时最稳定

提高温度，溶解度增加，但易使大分子物质变性失活。

小分子物质：50－70℃；生物大分子：0－10℃，最好控制在0－4℃

〔5〕搅拌：

搅拌能促使欲抽提物与抽提液的接触，并能增加溶解度。但是，一般宜采用温和的搅拌方法，速度太快时容易产生泡沫，导致某些酶类变性失