高效液相色谱法 (3).ppt

*由于离子对X+Y-具有疏水性，因而被非极性固定相提取。其它待测离子X1，X2，X3……..因与Y-离子间的成对能力不同，而形成不同疏水性的离子对，使得各待测物在柱内的保留值不同，从而达到分离的目的。*烷基铵盐离子对试剂，用于阴离子的分离；烷基磺酸盐离子对试剂，用于阳离子的分离。固定相：正相键合固定相；反相键合固定相。流动相：一般含有适当有机反离子的溶剂。2．固定相和流动相*四、离子交换色谱

ion-exchangechromatography固定相：阴离子交换树脂或阳离子交换树脂；流动相：盐类缓冲溶液（一定pH和离子强度）。1．固定相和流动相*基本原理：组分在固定相上发生离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷多少等有关。亲和力大，保留时间长。阳离子交换反应：R-SO3-Na++M+＝R-SO3-M++Na+阴离子交换反应：R-NR3+Cl-＋X-＝R-NR3+X-＋Cl-2．分离原理*在离子交换色谱中，常通过改变流动相的pH、离子强度等条件来控制分配比k，改变离子交换剂的选择性，进而影响待测物的分离。*五、体积（尺寸）排阻色谱

size-exclusionchromatography原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快。*尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子物质相对分子量的分布。它具有其他液相色谱所没有的特点：（1）保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息；（2）固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长；（3）不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须大于10％才能得以分离。*凝胶（具有一定大小孔隙分布）；指含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。排阻色谱固定相种类很多，按照耐压的大小一般可分为软质、半硬质和硬质凝胶三类。1．固定相*排阻色谱所选用的流动相必须能溶解样品，而且与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶。另外，溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离效果。2．流动相*六、亲和色谱法affinitychromatography原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。*生物大分子中具有这种亲和力，例如酶与底物、抗原与抗体、RNA与DNA等。先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂（环氧、联胺等），再连接上配基（酶、抗原等），这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。*一、高效液相色谱法的特点

featureofHPLC特点：高效、高压、高灵敏度、快速、应用广泛高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。*（一）固定相高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0×108～109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。*由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：（二）流动相（1）溶剂必须具有合适的极性和良好的选择性；能溶解样品但不与样品发生反应或聚合。（2）选用的溶剂与检测器匹配。*（3）高纯度。由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”；（4）低粘度（粘度适中）；若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。*液相色谱仪*二、高效液相色谱的流程及主要部件

processandmainassemblyofHPLC1.流程图*2.主要部件高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统；此外还有一些附属设备，如梯度洗脱、自动进样装置。(1)高压输液系统（a）高压输液泵：主要部件之一，压力：150～350×105Pa。*(b)梯度洗脱装置（梯度淋洗）所谓梯度洗脱就是流动相含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续改变流动相的配比和极性，以此来改变被分离组分的容量因子k和选择性因子?，达到缩短分析时间和提高分离效果的目的。**(2)进样系统通常使用耐高压的六通阀进样