酶的人工模拟.pptVIP

分子印迹用于拆分手性化合物利用手性化合物之一作为印迹分子，制作的分子印迹可作为层析介质，用于拆分不同构型的分子。（EDMA:交联剂乙二醇二甲丙烯酸酯）聚合单体丙烯酸印迹分子L-苯丙氨酰苯胺第96页,共108页，2024年2月25日，星期天生物印迹酶在水相介质中被印迹分子诱导的酶或非酶蛋白会产生“记忆”效应。如果将在水相中被印迹分子诱导而发生构象变化的蛋白质冰冻干燥，然后将其置于非水介质中，蛋白质将保持被诱导后的构象。如果所用印迹分子是酶的底物、竞争性抑制剂或底物的过渡态类似物，则此生物印迹蛋白可能表现出酶的活性。称为生物印迹酶。生物印迹酶只能在非水介质中催化反应，如果将生物印迹酶放到水介质中，则其诱导后的构象不能保持，失去催化能力。第97页,共108页，2024年2月25日，星期天非水相生物印迹酶水溶性脂肪酶在通常情况下是非活性的，其底物结合部位有一个“盖子”，当底物脂肪以脂质体形式接近酶时，盖子打开，脂肪的一端与底物结合部位结合。为了获得高效非水相催化的脂肪酶，Braco等将适当的两亲性表面活性剂与酶印迹，待表面活性剂分子与酶充分接触后，冰冻干燥，用非水溶剂洗去表面活性剂后，酶构象发生了变化，形成了活性部位开启的构象，提高了它与底物的亲和力，在非水介质中的催化效率提高了两个数量级。第98页,共108页，2024年2月25日，星期天非水相生物印迹酶可溶性酶印迹酶冻干，用无水溶剂洗脱两亲物并干燥第99页,共108页，2024年2月25日，星期天水相生物印迹酶Ⅰ在非水介质中被印迹分子诱导的酶或非酶蛋白产生的“记忆”效应，在水中会丧失。Keyes等用交联剂固定生物印迹酶的构象，结果产生了能在水溶液中高效催化的生物印迹酶。1984年，Keyes等报道了首例用这种方法制备的生物印迹酶。他们用吲哚丙酸为印迹分子，印迹牛胰RNA酶，待部分变性的牛胰RNA酶与吲哚丙酸充分作用后，用戊二醛交联固定印迹蛋白质的构象，经透析除去印迹分子后，得到的生物印迹酶在水溶液中具有催化酯水解的活性，而非印迹酶无此种活性。第100页,共108页，2024年2月25日，星期天水相生物印迹酶Ⅰ（续）前述生物印迹酶粗酶的比活性为7.3U/g，经70~90%硫酸铵分级纯化后，其酯水解的比活性升至22U/g，再经BioGelP-30（凝胶层析介质）进一步纯化后，得到了三种交联组分，其中低分子量组分显示出最高的比活性，达到了600U/g。研究表明，此印迹酶的最适pH、底物饱和特性以及产物抑制等均与天然酶相似，但却具有较宽的底物特异性。它对含芳香环的氨基酸乙酯表现出相当好的水解活性，而对非芳香环氨基酸乙酯水解活性较低。吲哚环诱导的芳香疏水结合部位对此酶结合含芳香基团的底物起到了关键作用。第101页,共108页，2024年2月25日，星期天水相生物印迹酶Ⅱ罗贵民等以GSH修饰物为印迹分子，诱导卵清蛋白产生GSH的特异结合部位，用戊二醛修饰后，再用化学方法将结合部位的Ser修饰成硒代半胱氨酸，得到了具有GPX活性的印迹酶，其比活性可达800U/mol，与天然兔肝GPX相比只差1个数量级。卵清蛋白印迹分子印迹酶第102页,共108页，2024年2月25日，星期天五、模拟天然酶催化机理的各个方面1．模拟酶的金属辅基例如，模拟过氧化氢酶分子中的铁卟啉辅基，合成了分解过氧化氢的酶模型——三亚乙基四胺与三价铁离子的络合物。这个模型在pH9.5和25℃条件下，其催化速率是血红蛋白或正铁血红素在同样条件下的1万倍。化学模拟生物固氮同样是模拟固氮酶的金属辅基。第103页,共108页，2024年2月25日，星期天2．模拟酶的活性功能基C.G.奥弗贝格等根据胰凝乳蛋白酶的催化中心与丝氨酸的羟基、组氨酸的咪唑基和天冬氨酸的羧基有关的事实，用乙烯基苯酚与乙烯基咪唑进行共聚合，制得带有羟基和咪唑基的α－胰凝乳蛋白酶模型。用这个模型聚合物作为3－乙酰氧基－N－三甲基碘化苯胺水解的催化剂，当pH为9.1时，其活性比单一的乙烯基咪唑高63倍。第104页,共108页，2024年2月25日，星期天α－胰凝乳蛋白酶模拟酶及其人工底物的结构模拟酶的结构底物水解位点第105页,共108页，2024年2月25日，星期天3．模拟酶的高分子作用方式酶是一类由氨基酸组成，以多肽链为骨架的生物大分子。人们利用高分子化合物作为模型化合物的骨架，引入活性功能基来模拟酶的高分子作用方式。例如，用分子量为40,000～60,000的聚亚乙基亚胺作为模型