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过表达及敲除细胞系建立及所需材料详细

汇报人：AA

2024-01-28

FROMBAIDUAA

引言

过表达细胞系建立

敲除细胞系建立

所需材料详细

实验步骤详解

结果分析与讨论

目录

CONTENTS

FROMBAIDUAA

01

引言

FROMBAIDUAA

CHAPTER

探究基因功能

通过过表达或敲除特定基因，研究其在细胞生长、分化、凋亡等过程中的作用。

疾病模型建立

模拟人类疾病中特定基因的异常表达或缺失，用于研究疾病发生发展机制和药物筛选。

基因治疗研究

通过基因过表达或敲除技术，研究基因治疗策略的有效性和安全性。

03

02

01

有助于深入了解基因在细胞生命活动中的作用，揭示生命现象的本质。

揭示基因功能

疾病机制研究

药物筛选和治疗策略开发

推动基因编辑技术发展

通过模拟疾病状态下的基因表达变化，有助于揭示疾病发生发展的分子机制。

建立的细胞系可用于药物筛选和评估治疗效果，为疾病治疗提供新的思路和方法。

过表达及敲除细胞系的建立需要依赖基因编辑技术，相关研究可促进基因编辑技术的不断完善和发展。

02

过表达细胞系建立

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CHAPTER

通过PCR扩增或合成目的基因片段，并在其两端添加适当的限制性内切酶位点。

目的基因获取

载体选择

酶切与连接

根据实验需求选择合适的表达载体，如质粒、病毒载体等。

使用限制性内切酶对载体和目的基因进行酶切，然后通过连接酶将目的基因连接到载体上。

03

02

01

03

筛选方法

在转染后，通过添加选择性培养基或药物等方法，筛选出成功转染并表达目的基因的细胞。

01

细胞准备

选择适当的细胞系，并在转染前进行传代培养，确保细胞状态良好。

02

转染方法

根据所选细胞系和载体类型，选择合适的转染方法，如脂质体转染、电穿孔转染等。

通过RT-PCR或实时荧光定量PCR等方法，检测细胞中目的基因mRNA的表达水平。

RNA水平检测

通过Westernblot、免疫荧光等方法，检测细胞中目的基因编码蛋白质的表达水平。

蛋白质水平检测

通过细胞增殖、凋亡、迁移等实验，验证过表达目的基因对细胞生物学功能的影响。

生物学功能验证

03

敲除细胞系建立

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CHAPTER

基因敲除定义

基因敲除是通过一定手段使特定基因失活或缺失，以研究基因功能的技术。

常用技术方法

包括同源重组、RNA干扰、CRISPR-Cas9等。

应用领域

广泛应用于基因功能研究、疾病模型建立、药物筛选等。

CRISPR-Cas9原理

01

CRISPR-Cas9是一种基于细菌免疫系统改造而来的基因编辑技术，通过设计特异性sgRNA引导Cas9蛋白对目标基因进行切割，实现基因敲除。

sgRNA设计

02

根据目标基因序列，设计特异性sgRNA，确保准确靶向目标基因。

Cas9蛋白表达载体构建

03

构建表达Cas9蛋白的载体，与sgRNA共同转染细胞。

基因组DNA提取

PCR扩增与测序

蛋白表达检测

功能实验验证

01

02

03

04

提取敲除细胞系的基因组DNA，进行后续验证实验。

通过PCR扩增目标基因区域，并进行测序验证敲除效果。

通过Westernblot等方法检测目标蛋白的表达情况，进一步验证敲除效果。

通过相关功能实验验证敲除细胞系的表型变化，以确认基因敲除是否成功。

04

所需材料详细

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CHAPTER

分子生物学试剂

包括DNA聚合酶、限制性内切酶、连接酶等，用于基因克隆和载体构建。

细胞培养试剂

如培养基、血清、胰蛋白酶等，用于细胞培养、传代和冻存。

转染试剂

如脂质体、电转液等，用于将外源基因导入细胞。

抗体和荧光染料

用于细胞免疫荧光实验，检测目标蛋白的表达和定位。

核酸提取试剂

用于从细胞或组织中提取DNA或RNA。

其他常用试剂

如PBS、抗生素、DMSO等。

提供适宜的温度、湿度和CO2浓度，用于细胞培养。

细胞培养箱

提供无菌操作环境，用于细胞培养、转染等实验操作。

生物安全柜

用于观察细胞形态和生长状态。

倒置显微镜

用于观察荧光标记的蛋白或细胞。

用于基因克隆和载体构建中的PCR扩增。

用于将外源基因通过电穿孔法导入细胞。

用于细胞分选、细胞周期和凋亡分析等。

荧光显微镜

PCR仪

电转仪

流式细胞仪

根据研究需要选择适当的实验动物，如小鼠、大鼠等，用于建立疾病模型或进行体内实验。

选择适当的细胞株进行实验，如人源或鼠源的肿瘤细胞系、正常细胞系等。确保细胞株的来源清晰、质量可靠，并经过必要的鉴定和验证。

细胞株

实验动物

05

实验步骤详解

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CHAPTER

选择合适的表达载体，如质粒或病毒载体，并插入目标基因序列。

设计过表达载体

将构建好的过表达载体转染