随机引物与oligodT_区别.docxVIP

1.Oligo(dT) capture 1.Oligo(dT) capture 因为 Oligo(dT)与mRNA 的 Poly(A)尾巴可以发生特异性结合，所以用 Oligo(dT)特异结合到mRNA 上Poly(A)尾端，以此可以特异地将 mRNA 从总RNA 中分离出来。属于亲和层 析技术。 2.反转录（RT-PCR） 因绝大多数真核细胞mRNA 3’端具有Poly(A)尾，Oligo(dT)与其配对，仅mRNA 可被反转录。由于 Poly(A) RNA 仅占总 RNA 的1-4%，故此种引物合成的 cDNA 比随机六聚体作为引物所得到的cDNA 在数量和复杂性方面均要小。但是在反转录从 mRNA 获得 cDNA 时，也可以用随机六聚体引物和特异性引物。 随机六聚体引物：当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mRNA。用此种方法时，体系中所有 RNA 分子全部充当了 cDNA 第一链模板，PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的特 异性。通常用此引物合成的 cDNA 中96%来源于rRNA。 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA 的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。 用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR 扩增。 使用 使用 oligo dT 引物扩增的产物, 可以保证扩增产物包括mRNA 的 3末端(减少 rRNA 的干扰), 但是 oligo dT primer 扩增有一个问题, 就是扩增片段的长度和扩增产物所包含的信息量的问题, 之所以有长度这个问题,一方面和lz 所提到的RNA 完整性有关,但最重要的限制在于逆转录酶的延伸能力. 用 oligo dT primer 扩增可能出现扩增出来的片段长度短 , 虽然都有mRNA 的 3端, 但是序列信息多位于 3-UTR 附近, 若扩增序列太短,则有用信息很少, 不利 于序列的识别和分析. 使用 random primer, 也有片段长度的限制, 但是由于它的逆转录并不一定在mRNA 的末端起始, 而是在随机位置起始,所以它的扩增片段带有更多 CDS 的信息.但是如果是用总 RNA 逆转录的话,有可能会受到 rRNA 的干扰. 至于 Gsp,只是在扩增已知 gene/gene family 以及部分原理的 RACE 中使用. 用随机引物时 要去除总 用随机引物时 要去除总 RNA 中的 tRNA rRNA, 只保留 mRNA 如果接下来你的 如果接下来你的 PCR 产物是外显子，就用 oligo dT; 如果是内含子或者包括部分内含子，就用random mRNA mRNA 反转录之后的 cDNA 为模板进行 PCR，不都是外显子吗？内含子在这之前都被剪切掉 了。所以不知道“内含子...”这句话是什么意思，或者有其他的含义，求解！ 如果你想要做蛋白表达，就用 如果你想要做蛋白表达，就用 Oligo dT，要是你做的基因包括内含子就用随机引物喽。 我最近在用逆转 我最近在用逆转 cDNA 为模板扩增 CDS 序列（3000bp 左右），同时用 oligodT 和 random 引物逆转，结果大多数时候两者扩增效果是一样的，少部分情况只有random 能扩出目的带， 尤其是中间段和靠近 5‘端的 CDS 区——这结果基本和网上很多资料相吻合——比如随机引 物更适合 CDS 长的、有二级结构的基因。 显然是选random primer 更好，其实说明书是有写的啦，原因是RT-PCR逆转录是要得到一个所有的 RNA 的 cDNA 库，然后再 P 出你要的“几个基因”，所以不是每个基因的 mRNA 都是有polyA 的，很多都是没有的，microRNA，piRNA，很多都没有哦，所以如果你用 oligo dT 引物，就自然会 miss 掉很多（确实是很多）的 RNA，而随机引物不会有这个问题，用它反转录出来的cDNA 丰度更高，结果更加准确 看你的目的基因的 看你的目的基因的 mRNA 有没有 polyA 尾巴 有的话就用 oligodT 没有的话就用随机引物 一般在反转录的时候除了引用特异性引物和 一般在反转录的时候除了引用特异性引物和oligodT 作为反转录得到第一条 cDNA 链外，运用随机引物的效果也很好，随机引物一般有 6-10 碱基的寡核苷酸引物，引物的序列是随机的，也就是说随机引物是各种引物的混合物，随机序列的肯能性很多，由于随机引物可能在一条 mRNA 链上有多个结合位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特长的CDNA；现在随机引物已经商品化， 没有必要自己合成，直