绵羊肺炎支原体TaqMan实时荧光PCR检测方法.pdfVIP

绵羊肺炎支原体TaqMan实时荧光PCR 检测方法 1 范围 本文件规定了绵羊肺炎支原体TaqMan实时荧光PCR检测方法。 本文件适用于绵羊肺炎支原体核酸的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本 （包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 实时荧光PCR：实时荧光聚合酶链式反应（Real-timepolymerase chainreaction） Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数（cyclethreshold） BHQ1：无荧光猝灭基团(Blackhole quencher-1) DNA：脱氧核糖核苷酸（Deoxyribonucleic acid) FAM：6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein) PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphatebuffered saline) Mo：绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae） Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNAploymerase） 5 试剂和耗材 5.1 试剂 5.1.1 无核酸酶水：2℃~8℃保存。 5.1.2 75%乙醇：用无水乙醇和无核酸酶水配制，-20℃预冷。 3 5.1.3 DNAzol：2℃~8℃保存。 5.1.4 8mmol/LNaOH 溶液：配制方法按附录A 中A.1。 5.1.5 30%甘油磷酸盐缓冲液：配制方法按附录A 中A.2。 5.1.6 阳性对照、阴性对照见附录A 中A.3 和A.4，其中阳性对照靶基因序列及质粒制备见附录B 中 B.1 和B.2。 5.1.7 0.01mol/L PBS 溶液：配制方法按附录A 中A.5。 TM 5.1.8 Taq 酶 （Premix Ex Taq （Probe qPCR））：内含TaKaRaEx TaqHS，dNTPMixture，Mg2+和 TliRNaseH。可采用等效商品化试剂。 注：除非另有说明，所有试剂均为分析纯，试验用水符合GB/T6682 的要求，所有试剂均用无核酸酶的容器分装。 5.2 耗材 5.2.1 离心管（1.5mL，5mL）。 5.2.2 荧光定量PCR 管（0.2 µL）。 5.2.3 医用棉拭子。 5.3 引物 绵羊肺炎支原体实时荧光PCR扩增用上、下游引物和探针序列见附录C。 6 仪器与设备 6.1 超净工作台。 6.2 荧光定量PCR扩增仪。 6.3 高速台式冷冻离心机，可控温至4 ℃，离心速度可达12000g以上。 6.4 微量移液器：量程为0.5 µL~10µL、2µL~20 µL、20 µL~200 µL和200 µL~1000µL。 6.5 涡旋震荡仪。 6.6 分析天平。 6.7 冰箱：2℃~8 ℃、-20℃和-70 ℃以下。 6.8 水浴锅：0 ℃~100 ℃。 6.9 组织研磨器或研钵。 6.10 高压灭菌锅。 6.11 电热恒温鼓风干燥箱：0℃~100 ℃。 7 样品的采集与处理 4 7.1 样品采集 7.1.1 采样工具 医用棉拭子、剪刀、镊子、5mL离心管、研钵。以上采样工具经121℃高压灭菌15min，在电热恒 温鼓风干燥箱内烘干备用。 7.1.2 组织样品 应采集疑似发病死羊的肺、肝、脾等组织。用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品，将采集的样品装入 一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，用冰盒运送至实验室冻存备用。 7.1.3 鼻拭子样品采集 用灭菌后干燥的棉拭子插入鼻腔，与鼻中隔平行方向插入约3cm~5cm，捻转至少3 圈，迅速抽出， 将鼻拭子样品端置于装有 1mL30%甘油磷酸盐缓冲液的5mL 灭菌离心管中，编号后保存于4 ℃环境 中送检。 7.2 样品处理 7.2.1 组织样品处理 将待检组织剪成小块，按 1g