基因操作常规技术详解演示文稿.pptVIP

FRET现象发生程度与供、受体分子的空间距离紧密相关,一般为7?10Bill时即可发生FRET; 随着距离的延长,FRET呈显著减弱趋势 猝灭作用(quenching effect): 荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用引起的荧光物质分子的荧光效率降低,或物质激发态的寿命缩短,从而导致荧光强度降低或消失的现象 猝灭剂(quencher): 一种可以加速电子激发态衰变到基态或低激发态的物质,即会导致荧光猝灭的物质 在PCR扩增中,模板变性退火时,引物、探针同时与模板结合. 在引物的介导下,探针沿模板向前延伸至探针结合处,发生链的置换,Taq酶的5?-3?外切酶活性(此活性是双链特异性的,游离的单链探针不受影响)将探针5?端连接的荧光基团从探针上切割下来,游离于反应体系中,从而脱离3?端荧光淬灭基团的屏蔽,接受光刺激发出荧光信号,即每扩增1条DNA链,就有1个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步 ①引物、探针的设计: 探针Tm为68-70℃,30bp, 5’不能有G,G可能会淬灭荧光素,引物尽量靠近探针,扩增片段400bp,引物Tm为59-60℃ ②反应参数的确定: 95℃ 3?, 94℃ 15s, 60℃ 60s,40循环; Taq酶5?→3?外切酶活性在60℃最高,也可通过温度梯度优化退火温度 ③引物和探针(PP)浓度的优化: 获得最小Ct值,最大信号/背景比值,引物浓度为50-900nM; 探针浓度为50-250nMPP 优点: 对目标序列的高特异性--阴性结果确定 Beacon: 灯塔, 信标; fluorophore: 荧光团. 环(15-30 bp)与目标序列互补; 茎(5-7 bp)由互补配对的序列组成; 发夹型荧光探针(分子信标)是加入了荧光基团和猝灭基团的探针, 在结构上是环状的寡核苷酸探针, 由茎部和环组成, 其中茎由互补配对的序列组成, 环与目的序列完全配对; 分子信标是一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针,它把荧光基团标记的发夹结构的序列直接与模板结合,从而使荧光标记基团直接掺入PCR扩增产物中,本质上是一种标记荧光的发夹探针. 当探针分子呈发夹结构时,结合在其两端的荧光基团距离上接近,使得产生能量转移效应,不发生荧光 FISH: fluorescent in situ hybridization. FISH技术是一种检测基因突变的分子细胞技术,具有操作简单,重复性好、灵敏性及特异性高的特点; 比传统方法可更早发现细胞异常,能大幅度降低漏诊率; 其检测快速无创,非常适合膀胱癌的早期检测和复发监测.目前大部分膀胱癌患者可通过手术治疗,但手术后两年内复发率达到40-70%,因此早期诊断和复发监测尤为重要. 新技术可显著提高膀胱癌的诊断水准,对复发监测有很好的应用前景 中国男性膀胱癌年发病位居泌尿系统肿瘤第一位, 男性年发病率已达8-10万,呈逐年上升趋势. 临床诊断普遍使用膀胱镜有创检查,给病人造成极大痛苦,而细胞学检测因敏感性低易造成漏诊. 卫生部医药卫生科技发展研究中心2009.10.22公布的基因检测新技术研究成果则有效解决了这一问题 以菌落(噬菌斑)为对象检测重组子的技术; 依重组质粒(phage)的靶序列,合成与之互补的DNA片段, 作杂交探针. 用途: 从未知重组子检测与探针序列互补的阳性重组子 Khorana(1970): 聚合酶链反应的设想; Mullis(1985): Klenow酶扩增哺乳动物单拷贝基因, NP(1993) This new model is at the cutting edge of computer technology. 这种新的型号处于计算机技术(发展)的先锋地位. cutting edge: 先锋地位 平台效应与下列因素有关: ①随着循环次数的增加, 引物和dNTP浓度降低, 掺入速度减慢; ②随产物增加, 酶与模板的比例下降; ③非特异产物或引物二聚体与反应物竞争; ④产物降解 Linear (high variability): the reaction components are consumed a lot, the reaction is slowing, and products are starting to degrade Plateau : the reaction has stopped, no more products are being made and if left long enough, the PCR products will begin to degrade 1mol物质的分子数= 6.02?1023个分子, 故1克1kb DNA的分子数= 6.02?1023/660?1