固相萃取-酵母双杂交法检测污水中内分泌干扰活性.docxVIP

固相萃取-酵母双杂交法检测污水中内分泌干扰活性 1 edcs的危害 宫内干预物（idbs）是指模拟自然激素的生理和生化作用，干扰或抑制生物内政部、神经、免疫、生殖系统功能障碍和逆转或不可逆性生物学效应的材料（colboretal.，1993）。它主要由固体激素、表面活性剂、工业化合物、添加剂和食品添加剂组成。根据该报告，水中添加了几毫克二醇乙醇，这可能会导致鱼类的生殖系统紊乱，如妊娠不育和自然流产，这会导致人体精气的质量下降，以及乳腺癌、卵巢动物和前列腺肿瘤的发病率增加（dannital.，2006）。 水资源短缺已成为世界范围内存在的问题,而在我国尤为严重.污水回用将是缓解水资源短缺的有效措施,而城市污水处理厂对各种有毒有害物质的去除效率直接关系到污水回用的安全性.生活污水和工业废水是水环境中EDCs的主要来源,因而城市污水处理厂对于控制、阻断EDCs进入到天然水体中发挥了重要的作用.国外许多学者对城市污水处理厂去除EDCs进行了很多研究,但大多数只调查了EDCs的浓度变化,仅有少数研究对EDCs的毒性进行了评价,且多数是研究总体去除率,对于各个工艺的去除研究较少;而在国内,关于东北寒冷地区城市污水厂对内分泌干扰物活性的去除情况未见报道.所以,非常有必要对东北寒冷地区城市污水处理厂去除EDCs的情况进行深入调查研究. 本研究以东北寒冷地区某城市污水处理厂一沉池进水(原污水)、一沉池出水及二沉池出水为研究对象,该污水处理厂采用典型的活性污泥工艺,其流程图和取样点如图1所示.使用固相萃取-酵母双杂交法测定了内分泌干扰活性随季节的变化及各工艺阶段的去除情况,旨在为污水厂强化、提高EDCs的去除提供基础科学依据. 2 材料和方法表面活性剂 2.1 试剂和仪器 雌二醇(17β-Estradiol,E2)、二甲基亚砜(Dimethyl Sulphoxide,DMSO)和邻硝基酚β-D-半乳糖苷(o-Nitrophenyl β-D-galactopyranoside,ONPG)购自Sigma公司,HPLC级甲醇购自Dikma公司,色谱纯级二氯甲烷与氯仿购自天津科密欧公司,无氨基酸酵母氮碱(yeast nitrogen base without amino acids)购自Difco公司,DO/-Leu/-His添加剂购自Clontech公司,其余试剂为国产分析纯,超纯水(18.2MΩ·cm)为Milli-Q纯水仪制得. 2.2 水样总治理冻干处理 在2006年8月至2007年4月的春、夏、秋、冬四季中,用棕色带盖4L玻璃瓶同时采集了一沉池进水、一沉池出水及二沉池出水,各水样采样量为20L.水样取回实验室后立即用1μm玻璃纤维滤膜(Whatman)过滤,将滤过液用浓硫酸调pH2后固相萃取富集,对膜上截留的颗粒物质采取冻干处理.实验用玻璃器皿及玻璃纤维滤膜全部预先在500℃温度下灼烧2h.实验选用Waters C18固相萃取小柱,在水样浓缩前依次用5mL甲醇与5mL Milli-Q水活化小柱,富集时调节系统(Supelco VisiprepTMDL十二管防交叉污染固相萃取装置)真空度使水样过柱流速大约控制在10mL·min-1.洗脱前首先用10mL超纯水清洗小柱,真空干燥后用甲醇/二氯甲烷(80/20,体积比)混合洗脱液共10mL分2次洗脱柱子.2次洗脱液合并后,轻柔氮气吹干,最后用DMSO定容.各水样富集浓缩125~2000倍. 将已冻干截留有颗粒物质的玻璃纤维膜剪成小块,加一定量的甲醇/二氯甲烷混合萃取剂隔夜浸泡,并超声波辅助萃取,萃取液氮气吹干后DMSO定容.考虑到实验所用溶剂及样品浓缩富集过程中有空白来源,所以对3份1000mL超纯水做相同处理作为试剂空白,结果均呈阴性反应.上述2部份测定结果之和为水样总内分泌干扰活性. 2.3 lm-4诱导活性测定 所采用的酵母菌由中国科学院生态环境研究中心提供.该酵母菌是人工构建的一种能够同时表达人雌激素受体基因和受体共激活因子GRIP1基因的双杂交酵母,与单杂交酵母菌相比,该酵母菌由于具有受体共激活因子,所以具有能模拟真核细胞真实情况、不容易产生假阴性或假阳性的优势,是一种体外筛选拟雌激素效应环境化合物的高效测试技术(Raoet al., 2004). 具体测试方法见参考文献(Maet al.,2007).具体地说,将菌种接种至SD/-Trp/-Leu培养基中,在30℃、130r·min-1条件下培养,当菌液生长至600nm处吸光度值(OD600)介于2~6之间时,用新鲜的同一种培养基稀释该菌悬液至OD600值为0.75左右,移取稀释后的菌悬液0.995mL于1.5mL离心管中,并加入5μL待分析样品,振荡混匀.然后从离心管中移取200μL样品至96孔板中,做4个平行样,于30℃、800r·m