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卷柏属药材穗花杉双黄酮含量测定 柏树是柏树科的一种干燥的柏树草。它生长在干燥的岩石上。目前，发现了约700种，分布在世界各地，中国约50种，约25种药物。卷柏属药用植物中主要成分是双黄酮, 其中包括由芹菜素、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮和异柳杉素等活性物质, 广泛用于经闭痛经、癜瘕痞块、跌打损伤、化淤止血、吐血、崩漏、便血、脱肛等治疗中。其中以穗花杉双黄酮是卷柏的代表性、特征性化学成分, 具有广泛的药理活性, 研究表明穗花杉双黄酮及其衍生物可作为一类新的天然的人组织蛋白酶抑制剂, 具有神经保护作用, 且其在卷柏中的含量远高于其他中草药。但《中国药典》质量标准中缺乏对常见卷柏中穗花杉双黄酮含量的测定, 本文旨在建立测定穗花杉双黄酮含量的反高效液相色谱法, 并对常见的5种卷柏属药材中穗花杉双黄酮进行含量测定, 为有效控制卷柏药材及其制剂质量提供了科学依据。 1 材料和方法 1.1 仪器、试剂和试剂 仪器:Agilent110高效液相色谱检测仪 (二极管阵列检测器) ;超纯水器 (960002型, 美国Labconco公司) ;分析天平 (沈阳龙腾电子有限公司) ;超声波清洗机 (昆山市超声仪器有限公司, KQ-250型) ;奥立龙828酸度计 (美国奥立龙公司) 。 试剂:穗花杉双黄酮标准品和测定样品:江南卷柏、簿叶卷柏、深绿卷柏、单籽卷柏、兖州卷柏) 购置于中国药品生物制品检定所;甲醇 (色谱纯, 山东禹王实业有限公司化工分公司) ;磷酸 (优级纯, 天津科密欧化学试剂有限公司) ;水为重蒸水。 1.2 方法 1.2.1 流动相、柱温 色谱柱为PurospherstarC18柱 (250×4.6mm, 5μm) ;流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液 (65:35) ;超声波脱气;流速设定为0.8ml/min;柱温设定为30℃;检测波长为337nm;理论塔板数按穗花杉双黄酮峰计算不低于6000。 1.2.2 穗花杉双黄酮准储备液的配制 准确称取穗花杉双黄酮准品10.3mg, 置于50ml容量瓶中, 用甲醇溶解并稀释定容至刻度, 涡旋振荡充分溶解, 此溶液为0.206g/L的穗花杉双黄酮准储备液, 放入4℃冰箱中备用。 1.2.3 提取液的制备 将上述5种样品粉碎, 过筛后精确称取1g, 置于索氏提取器中, 以70ml氯仿回流脱色至无色后过滤, 残渣加入70ml甲醇, 充分溶解后加热回流提取至溶液呈无色, 过滤, 将提取液蒸干, 残渣复加甲醇溶解并定容至50ml。 1.3 统计方法 所有数据分析采用SPSS13.0进行统计学分析, 均数以 (uf8e5x±s) 表示, 以α=0.05为检验水准。 2 结果 2.1 方法的特异性研究 流动相未干扰穗花杉双黄酮出峰, 出峰时间为19.83±0.14min, 见图1-2。 2.2 标准曲线方程 精密吸取穗花杉双黄酮标准品3、6、9、12和15μl依次进样, 每个进样5次, 以穗花杉双黄酮峰面积 (Y) 对浓度 (X) 进行线性回归, 得标准曲线方程:Y=3853.510X+17.426 (r=0.9994, P=0.018) , 线性范围为0.05-0.60μg。 2.3 加标回收率试验 精密吸取同一标准品溶液15μl, 重复进样5次, 分别测定峰面积, 计算RSD%。精密称取已知含量的样品约1.5g, 共6份, 精密吸取并加入0.2mg/ml的穗花杉双黄酮溶液1.0ml, 按供试液的处理方法, 制备溶液。分别量取进样15μl, 计算加标回收率。经测定RSD%=4.3%, 回收率为98.5%, 表明本方法准确, 可靠, 精密度高。 2.4 稳定试验 取同一浓度标准品溶液, 每隔2h进样一次, 共5次, 测定峰面积, 计算RSD%, 结果表明RSD=0.15%, 稳定性良好。 2.5 样品中穗花杉双黄酮浓度的测定 5种卷柏样品分别称取相同重量, 按照项目“1.2.3”程序制备溶液, 并按“1.2.1”色谱条件进样, 每次进样10μl, 每个样品进样5次, 测定样品中穗花杉双黄酮浓度, 见表1。 3 卷柏类药物中穗花杉双黄酮含量测定的价值 卷柏类药物临床应用广泛, 具有多种药理学作用, 研究表明其主要活性物质穗花杉双黄酮具有组织蛋白酶抑制剂作用, 可对氧化和β淀粉状蛋白质引起的神经细胞毒性有较强的保护作用, 且可以对局部脑组织缺血性抽搐和阿尔兹海默症等神经退化性病变具有一定的治疗效果, 因此受到医药领域的广泛关注。 《中国药典》对卷柏类药物中穗花杉双黄酮的作用等虽然有明确记载, 但却缺乏对常见卷柏中穗花杉双黄酮含量的测定标准, 极大程度上限制了临床药物质量的检验工作。液相色谱法在穗花杉双黄酮的含量检测方面已有应用, 检测效果比较好, 但部分研究表明梯度洗脱有程序繁琐, 且耗时长等缺点, 因此, 本