异源性膀胱脱细胞基质的制备及生物安全性评价.docxVIP

异源性膀胱脱细胞基质的制备及生物安全性评价 随着组织工程的发展，组织工程的原理和方法在膀胱重建的基础和临床应用中得到了广泛应用。组织工程膀胱的原理是通过将体外培养的种子细胞接种至支架材料上,形成细胞-支架材料复合体进行膀胱的替代重建,构建组织工程膀胱。膀胱脱细胞基质(bladder acellular matrix,BAM)是通过将膀胱进行脱细胞处理后得到的支架材料,保留有细胞外基质的结构和功能,以及一些有利于组织再生的生物活性因子,是目前研究和应用较多的一种用于组织工程膀胱构建的支架材料。研究者们采用同种异体BAM单独修补膀胱或接种细胞后用于膀胱的替代重建,均可观察到膀胱各层组织的再生。袁铭等采用低渗-去污剂洗涤-核酸酶消化法制备猪源性BAM,去除了猪膀胱内源性反转录病毒,具有良好的生物安全性,可进行异种移植。但对于猪源性BAM进行异种移植后的局部和全身反应,目前尚罕见相关报道。 我们在前期研究中采用扩张方法,联合使用物理、化学及酶消化法对新鲜猪膀胱进行脱细胞处理,并将其冷冻、冻干、灭菌,成功制备一种疏松多孔的保留有生物活性因子的BAM,并申请了国家发明专利获得授权。本研究中将我们制作的猪BAM进行异种移植修复兔膀胱缺损,观察其促进兔膀胱再生的作用,并评价其局部及全身安全性,为异源性BAM在膀胱替代中的应用奠定实验基础。 1 材料和方法 1.1 验动物及仪器 成年雄性新西兰大白兔18只,体重2.5~3.0 kg,购自金陵种兔厂;猪膀胱和尿道组织取自其他实验用猪(中华实验用猪,雌雄不限,体重15~30 kg);实验动物使用和操作遵循南京大学医学院附属鼓楼医院动物实验伦理委员会相应规定。 小鼠抗α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗体、DNaseⅠ、RNase A(Sigma-Aldrich公司,美国)。组织包埋机(Sakura公司,日本);石蜡切片机(Microm公司,德国);7600全自动生化分析仪(Hitachi公司,日本);BX20显微镜成像系统(Olympus公司,日本);DS-Fil图像采集系统(Nikon公司,日本)。 1.2 猪扁的制备和测试 1.2.1 猪人类mda的提取和小鼠bam的制备 根据我们前期的研究方法制备猪BAM。将猪膀胱和尿道组织置于4℃预冷的PBS中,胰蛋白酶/EDTA消化液浸泡,室温消化2 h;低渗Tris缓冲液浸泡,4℃静置过夜,使膀胱细胞肿胀;再经含1.0%Triton X-100的高渗Tris缓冲液室温振荡洗涤24 h,使得膀胱细胞破膜脱水;最后加入含50 U/m L DNaseⅠ和1 U/m L RNase A的10 mmol/L Tris-HCl洗涤液室温振荡洗涤24 h,以消化细胞核,去除猪膀胱DNA和RNA成分;经PBS及无菌去离子水冲洗后,得到猪BAM。于—70℃冷冻3 h后置入冷冻干燥仪中冻干,环氧乙烷灭菌,4℃密封保存。 1.2.2 he染色和masson染色 将制备的猪BAM经10%中性甲醛固定,制备石蜡标本切片,行HE染色和Masson三色染色,观察脱细胞效果;将冻干后的猪BAM剖开,暴露纵切面,镀金后扫描电镜观察其超微结构。 1.3 阴道肌肉注射和大鼠bam联合应用 将新西兰大白兔随机分为实验组(n=12)和对照组(n=6)。将兔以氯胺酮(50 mg/kg)联合氟哌利多(2.5 mg/kg)肌肉注射麻醉后,手术区域备皮、消毒。取下腹部正中切口,依次切开皮肤各层,暴露膀胱并充分游离,经注射器将生理盐水注入膀胱内使其充分充盈,切除原膀胱面积的30%。实验组采用与切除面积等大的猪BAM进行替代修补;对照组直接行膀胱切口原位缝合。术后两组动物自由进食、饮水,连续3 d肌肉注射青霉素(40万U/次,2次/d)预防切口感染。 1.3.1 体重和体温改变 术后观察兔的精神状态、食欲及大、小便情况,检测体重和体温改变;分别于术后15 d和1、2、3、6个月每组各取3只兔静脉采血检测血常规、肾功能、电解质。 1.3.2 阴道内的压力检测 术前和术后1、2、3、6个月每组取3只兔进行膀胱尿流动力学测定。同上法麻醉后,经尿道置入Fr8导尿管,排空膀胱;然后换用连接有压力感受器的导尿管,连接压力感受器及生理盐水灌注导管,排出压力检测导管内的空气;平衡后,向膀胱内匀速灌入37℃预热的生理盐水,记录膀胱内压力变化;直至兔开始排尿,记录最大膀胱容量和排尿时的膀胱内压力。并根据以下公式计算膀胱顺应性:最大膀胱容量/排尿点膀胱内压力。 1.3.3 术后睾丸愈合 术后各时间点行膀胱尿流动力学测定后,实验组分别处死3只兔,对照组分别处死1、1、1、3只兔,行下腹正中切口暴露膀胱,找到术区膀胱观察其愈合情况,表面有无瘢痕形成,与周围组织有无粘连;然后切开膀胱,观察膀