SNT 1559-2010非洲猪瘟检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1559—2010代替 SN/T 1559.1-—2005、SN/T 1559.2—2005、SN/T 1559.3--2005非洲猪瘟检疫技术规范Protocol of quarantine for African swine fever2010-09-16实施2010-03-02发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 1559-2010前言本标准代替SN/T1559.1—2005《非洲猪瘟直接免疫荧光试验操作规程》、SN/T1559.2--2005《非洲猪瘟间接免疫荧光试验操作规程》、SN/T1559.3---2005《非洲猪瘟病毒红血球吸附试验操作规程》。本标准的附录 B为规范性附录,附录 A、附录 C、附录 D和附录 E为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人：罗宝正、潘文波、林祥梅、曾少灵、薄清如、吴绍强、徐海聂、杨素。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 SN/T 1559—2010非洲猪瘟检疫技术规范1 范围本标准规定了非洲猪瘟红细胞吸附试验、荧光抗体试验、聚合酶链式反应和 Taqman 探针荧光PCR、酶联免疫吸附试验、间接荧光抗体试验和免疫印迹试验的技术要求。本标准适用于非洲猪瘟的检疫。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB19489　实验室　生物安全通用要求3缩略语下列缩略语适用于本标准。3. 1ASF:非洲猪瘟。3.2ASFV:非洲猪瘟病毒。3.3HAD:红细胞吸附。3.4FAT：荧光抗体试验。3. 5PCR:聚合酶炼反应。3.6ELISA：酶联免疫吸附试验。3.7IFAT：间接免疫荧光抗体试验。3.8MEM:最低基础培养基。3.9PBS:磷酸缓冲溶液。3.10EDTA:乙二胺四乙酸。3.11CPE:细胞病变效应。3. 12dNTP:脱氧核糖三磷酸。 SN/T 1559-20103.13DNA:脱氧核糖核酸。3.14Ct:循环阈值。3.15FITC:异硫氰酸荧光素。4初步诊断参照附录 A中的临床症状和病理变化做出初步诊断,确诊还需实验室诊断。实验室诊断方法见第5 章至第 11 章。5病毒红细胞吸附试验(HAD)5.1材料%氯化钠：配制方法见附录B。1 mol/L pH 7.4 PBS:配制方法见附录 B。5.1.3青霉素、链霉素、庆大霉素和制霉菌素。使用前用上述PBS分别配成 10 000 IU/mL、10mg/mL、500 IU/mL 和 500 IU/mL 的溶液。5.1.4肝素:使用前用0.9%氯化钠配成1000 IU/mL。5.1.5细胞基础培养液：配制方法见附录B。5.1.61%猪红血胞：配制方法见附录B。5.1.7非洲猪瘟标准毒株。试验环境和防护要求见 GB 19489,以下病毒操作的过程都按此要求。5.1.8待检样品：包括肝素(或 EDTA)抗凝血和脾脏、扁桃体、肾脏、淋巴结等组织。被检样品在运输过程中应尽可能的低温保存，但不能使样品冻结。样品到达实验室之后，如果不是立刻用于诊断，应该保存在一70℃冰箱。5.2操作方法5.2.1制备组织悬液在放有灭菌砂子的研钵中,用组织研磨器或捣碎器将被检组织磨碎,加人 5 mL～10 mL 含抗生素的PBS(pH7.4），制成组织悬液（每毫升组织悬液的抗菌素含量为：青霉素1000 IU,链霉素1mg，庆大霉素 50 IU和制霉菌素 50 IU）。将组织悬液1000g离心5min,取上清保存在 4℃备用。5.2.2制备白细胞采取健康猪血，用玻璃珠脱纤或用肝素抗凝（每毫升猪血含肝素100 IU），700g离心30min，将上层血清或血浆吸出备用。吸取中间淡黄色白细胞层，加三倍体积的0.83%氯化铵溶液，混合后室温孵育15min，650g离心15min，小心转移上清液，剩下的细胞沉淀用细胞基础培养液或PBS洗涤3次，备用。5.2.3制备细胞培养液将上述血清或血浆加人细胞基础培养液内配制成细胞培养液，血清或血浆的终浓度为10%～一30%，同时加入抗生素。5.2.4培养白细胞将白细胞悬浮于细胞培养液中，使细胞含量为 106个/mL～10²个/mL,分装于 160 mm×16 mm的管中,每管 1.5mL,将试管与水平面呈 5°～10°倾斜放置，置于 5%二氧化碳环境中,37°培养2d～4d。这一过程也可以在 96