SN 1207-2003猪痢疾短螺旋体分离培养操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1207-2003猪痢疾短螺旋体分离培养操作规程Protocol of isolation and culture of brachyspirahyodysenteriae for swine dysentery2003-03-17发布2003-09-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准猪痢疾短螺旋体分离培养操作规程SN/T 1207—2003*中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045电话：6852394668517548中国标准出版社案皇岛印刷厂印刷*开本 880×1230 1/16印张 1/2字数 8千字2003年6月第一版　2003年6月第一次印刷印数 1-2 000*网址 www. bzcbs. com侵权必究版权专有举报电话：(010, SN/T 1207-2003前言本标准是根据《中华人民共和国进出境动物检疫规程手册》（1997)中方法，并结合猪痫疾诊断方法的研究基础及实践经验编写制定。本标准的附录 A是规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国湖北出人境检验检疫局、华中农业大学。本标准主要起草人：张四喜、陈焕春、金梅林、徐共和、刘建杰、徐家文、蔡立新、王光亭。I SN/T痢疾短螺旋体分离培养操作规程1 范围本标准规定了猪痢疾短螺旋体分离培养的方法。本标准适用于实验密对猪痫疾的诊断。2缩略语下列缩略语适用于本标准。2. 1 SD:猪痫疾。2.2B. h:猪痢疾短螺旋体。2.3B.i:非致病性短螺旋体。2.4B.p:结肠菌毛样短螺旋体。3猪痢疾短螺旋体分离培养3.1材料准备厌氧罐、高纯度氢气、高纯度二氧化碳、真空泵、恒温箱、触媒、培养、d9 cm的培养血、抗生素、脱纤牛血等。3. 2 病料的采取和保存采取新鲜粪便、肠内容物或病变粘膜，不要冰冻，迅速镜检或分离培养。粪便等拭子可置于含有0.5mL磷酸缓冲盐水(0.01mol/L,pH7.2)(见第A.4章)的试管内，密封后0℃～4℃保存，3d内必须分离培养。两头结扎的结肠段,0℃～4℃可保存5d～7d。3.3 分离用培养基猪痢疾短螺旋体(B.h)选择分离培养基BJ,其成分和配制方法见附录A,培养基现用现配。3.4操作方法将病料作直接划线或用无菌缓冲液(0.01 mol/1.PBS,pH7.2)1：10稀释后接种于BI培养基，置厌氧培养器内42℃培养，隔3d～5d检查，无菌生长判为阴性。如有B.h生长可见到β溶血区，溶血区呈条状或一端稍尖的圆形斑点，此与其他细菌在菌落周围形成圆形溶血区有明显不同。经镜检有B.h样微生物时（2个～4个螺旋、两端尖锐的蛇样菌），即可在无杂菌的溶血区挑取一小块琼脂，接种于BI培养基37℃培养分离纯培养。在厌氧培养器与抽气机之间，连接负压表、二氧化碳袋和氢气袋各-只，先将容器内空气抽除，然后按负压表上的刻度放进20%二氧化碳和80%氢气。容器内应预先放人适量冷钯触媒（105催化剂），用过的冷钯经160℃烤2h后可反复使用。B. h 在形态上与 B. p、B. i 相同,仅可根据血液琼脂平板上 β溶血的强(B. h)弱(B. p、B. i)来作初步区分，最终确定应作生化鉴定和致病性测定。4生化鉴定三种细菌的生化区别见表1。 SN/T 1207-—2003表 1非致病性短螺旋体结肠菌毛样短螺旋体实验猪疾短螺旋体粥弱强溶血+1吲哚+马尿酸盐水解++α-半乳糖苷酶活性+α-葡萄糖苷酶阳性活性++β-葡萄糖苷酶活性注：+ 阳性反应；一阴性反应。致病性测定5致病性测定需用10 代以内的菌种。将在血液琼脂平血上的菌落用生理盐水冲洗，低速离心去琼脂,使每mI.含 5.0X10° 个菌体。结肠接种：取两周龄健康(或SPF)仔猪两头，饥饿48h。全身麻醉后剖腹暴露结肠，先注人200ml～400 mL灭菌生理盐水,用手将肠内容物向后推移。结扎 8 cm～10 cm 肠段,每段间隔 2 cm,不要损伤血管。一头猪视需要能结扎 6 个～10 个肠段,可同时测定 5 个～9 个菌株的致病性。每个肠段注人5 mL菌液(即 5 mL×5.0×10? 个菌体),另设一肠段注射 5mL生理盐水作为对照。另一头接种相同的菌株和菌量，但肠段部位的前后顺序与第一头相反。接种后缝合腹腔,不给食，隔 3d剖检。如接种肠段比对照肠段明显肿胀、液体增多、充血显著且涂片镜检的病原菌形态特征与自然病例一致，则认为此菌株有致病性。 SN/T 1207—2003附录A(规范性附录)BJ 培养基及试剂的配制A.1 基础培养基15 g膝(Trypticase)5g植物蛋白陈(Phytone)5g