SN_T 3731.5-2013食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法 第5部分：鸭成分检测 　PCR法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3731.5--2013食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第5部分：鸭成分检测PCR 法Identification of poultry ingredient in food and feed-Part 5 : Detection of duck ingredient--PCR method2013-11-06 发布2014-06-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3731.5—2013前言SN/T3731《食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法》共分为以下6个部分：第1部分：鹤鹑成分检测　PCR法，第2部分：鹅成分检测　PCR法；—一第3部分：鸽子成分检测　实时荧光PCR法；第4部分：火鸡成分检测　实时荧光PCR法;—第 5 部分:鸭成分检测　PCR法;一一第6部分：鹧鸪成分检测实时荧光PCR法。本部分为SN/T3731的第5部分。本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。本部分主要起草人：宗卉、吴亚君、陶虹、花群义、曹琛福、黄文胜、张娟、刘建利、吕建强、卢体康。I SN/T 3731.5—2013食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第 5 部分：鸭成分检测　PCR 法1范围SN/T3731的本部分规定了食品及饲料中鸭成分极测的PCR方法。本部分适用于食品及饲料中鸭成分的定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1多聚酶链式反应polymerase chain reaction ; PCR一种体外扩增DNA 的方法。CR使用一种热的多聚酶,以及两条含有 20 个左右碱基的单链引物。经过高温变性将模板DNA分离成两条链，低温退火使得引物和一条模板单链结合，然后是中温延伸，反应液的游离核苷酸紧接着引物从5端到3端合成一条互补的新链。而新合成的DNA又可以继续进行上述循环，因此 DNA的数目不断倍增，3.2Tag DNA 酶Thermus aquaticus DNA polymerase从 Thermus aquaticus 细菌中提取的耐热 DNA-聚合酶4缩略语下列缩略语适用于本文件。dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate)CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammonium bromide)Tris:三(羟甲基)氨基甲烷tris(hydroxymethyl)aminomethane]EDTA:乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid)DNA Marker:核酸相对分子质量标准5　方法提要样品经研磨混匀后，提取 DNA，以DNA为模板，采用鸭线粒体细胞色素C氧化酶Ⅲ基因特异性检1 SN/T 3731.5--2013测引物进行PCR扩增，经电泳，在226bp大小处观察是否有扩增条带，必要时进行测序，来判断样品中是否存在鸭成分。6试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。6.1检测用引物(对)序列鸭成分扩增引物详见表1。表 试验用引物名称序列(5-3)目的基因F:5-CTCATCTATCCTGCTAGCCGC-3鸭成分5端引物鸭线粒体细胞色素C氧化酶Ⅲ基因鸭成分3”端引物R:5-GCCTAGTTCGGGGGTTGGTA-36.2试剂裂解液:1% CTAB; 0.05 mol/L Tris-HCI(pH8.0); 0.7 mol/L NaCl; 0.01 mol/L EDTA6.2.1(pH8.0)。6.2.2DNA 聚合酶。6.2.310×PCR 缓冲液。6.2.4硫酸镁。6.2.5dNTP混合液。6.2.675%乙醇。6.2.7三氯甲烷。6.2.8异丙醇。6.2.9电泳缓冲液:Tris 54 g,硼酸 27.5 g,0.5 mol/L EDTA·Tris-HCl(pH8.0)20 mL;加蒸馏水至1000 mL;使用时10 倍稀释。6.2.10溴化乙锭（或等效染色剂）。6.2.11上样缓冲液。7仪器和设备7.17离心机（最大离心力大于12 000 g）。7.2微量移液器(100 μL～1 000 μL,20 μL～200 μL,2