SN_T 3330-2012中国鲎物种鉴定方法 PCR方法.pdf

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SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3330-2012PCR 法中国鲨物种鉴定方法Protocol of identification for Tachypleus tridentatus-PCR method2012-12-12 发布2013-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3330-2012前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国烟台出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主要起草人:尹伟力、方绍庆、王颖、岳志芹、许红岩、刘宁、钟响、鲁闽、段效辉、栾晶、张京宣、粟智平、耿金培1 SN/T 3330---2012中国鲨物种鉴定方法PCR 法1范围本标准规定了中国鲨物种 PCR鉴定方法。本标准适用于进出境水产品以及含有中国鲨成分的生物制剂中对中国鲨的鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必可少的。凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T 1193基因检验实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件,3.1聚合酶链式反应 polymernase chain reaetion;PCR以耐热DNA聚合酶和一对引物(与待测自标核酸分子序列同源的DNA片段)通过高温(DNA分子复性并被耐热/DNA聚合酶延伸)交替循环扩增待测目标核酸分子变性)和低温(引物利目标核酸分子的方法。4原理中国鲨(形态特征参见附录 A)样本经过提取总基因组DNA后,利用设计的特异性引物,通过常规PCR技术特异性扩增中国鲨mtDNACOX3基因片段(349bp)根据PCR扩增结果判定中国鲨样本的种类是否是中国鲨。特异性引物是通过比对中国鲨、圆尾聋、美洲鲨、南方鲨等大多鲨的mtDNACOX3基因片段设计出来的。5仪器设备和主要试剂5.1仪器设备PCR仪、组织研磨器、超净工作台、制冰机、高速冷冻离心机、水浴锅、台式小型离心机、常规冰箱、旋涡振荡器、电泳仪、凝胶成像系统。5.2主要试剂除另有规定外,所有试剂均为分析纯。5.2.1 水:应符合 GB/T 6682中一级水的规格。用于 PCR(包括核酸提取)时所用的水均用 DEPC处理以除掉 RNA 酶。1 SN/T 3330—20125.2.2苯酚。5.2.3三氯甲烷。5.2. 4蛋白酶 K。5.2.5异丙醇。5.2.6无水乙醇。5.2.775%乙醇。5.2.8硫酸镁。5.2.9 dNTP.5. 2. 10TaqDNA 聚合酶。5.2. 11PCR缓冲液。5. 2. 12DNA Marker 2003核酸染料。5.2.14琼脂糖。5.2. 15电泳缓冲液(配方见附录B)。5.2. 16上样缓冲液(配方见附录B)。5.2. 17引物:COX3 F:5-TTTAGGTCTGCGTTGAGG-3;COX3 R:5-GGCTGAGTCGGAAATAGA-3。6 鉴定方法6.1样品处理见附录 B。6.2 DNA 的提取样品DNA的提取可采用动物组织基因组通用试剂盒按说明书提取,也可采用常规抽提法(见附录B)。6.3 PCR6.3.1实验室的设置与管理实验室的设置与管理见SN/T1193的要求。6.3.2PCR反应体系在25 μL反应体系中,加人 2.5 μlPCR缓冲液,1 μLTaq DNA 聚合酶,,10 μmol/LCOX3F、COX3R 引物各 1 μL,10 mmol/L dNTPs 1 μL,50 ng/μL 模板 DNA 1 μL,补充水至 25 μl。6.3.3扩增程序PCR反应程序为:94℃ 5min;之后94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,共30个循环;最后72℃延伸 10 min。6.3.4琼脂糖电泳用电泳缓冲液制备1.5%的琼脂糖凝胶平板。将平板放人水平电泳槽,使电泳缓冲液刚好淹没胶2 SN/T 3330~2012面。向PCR扩增产物中加人六分之一体积的电泳上样缓冲液,混匀后加到样品孔。在电泳时设立DNA Marker2000做对照。5V/cm电泳约0.5h,当溴酚蓝到达一定位置时停止。在紫外灯下或凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性DNA电泳带,拍摄并记录。6. 3.5设立对照在样品处理过程中设立中国鲨阳性对照、阴性对照和空白对照。取从中国鲨肌肉组织提取的核酸模板基因组作为阳性对照。取不含中国鲨个体组织提取的核酸模板作为阴性对照。取等体积的水代替模板作为空白对照。7结果判定实验中阳性对照有349

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