SNT 2475-2010植物类病毒脱除处理规程.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2475—2010植物类病毒脱除处理规程Rules of plant viroids elimination2010-07-16实施2010-01-10 发布中华人民共和国发布r国家质量监督检验检疫总局数码院 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准植物类病毒脱除处理规程SN/T 2475—2010中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址 www.spc. net. cn电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16　印张0.5字数8千字2010年4月第一版　2010年4月第一次印刷印数 1-1 600书号：155066·2-20708 SN/T 2475—2010前言本标准的附录 A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：李桂芬、王仁睿、马洁、李明福、张永江、魏梅生本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 SN/T 2475—2010植物类病毒脱除处理规程范围?本标准规定了植物类病毒脱除处理方法本标准适用于检验检疫行业、农业、林业对带有类病毒的植物繁殖材料的脱除处理。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2. 1类病毒脱除处理viroid elimination通过有效的方法，脱去植物带有的类病毒的过程。2. 2组织培养 plant tissue culture在无菌条件下,将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体等繁殖材料，培养在人工培养基上，并在人工控制的环境中生长、分化、增殖至再生植株的过程。2. 3茎尖培养shoot apices culture在无菌条件下剥取植物茎尖(顶端分生组织带1个～2个幼叶原基），在人工控制的条件下分化再生的方法。2. 4低温处理 low temperature therapy将植物或植物组织置于低温环境下（2℃～7℃），黑暗或光照条件下持续处理6个月以上来抑制类病毒增殖的方法。2.5无类病毒苗viroid-free seedlings经过类病毒脱除处理过程和检测结果为阴性的再生种苗。3原理3.1处理原则针对检验检疫或生产中发现植物携带管制的类病毒，一般可进行销毁处理。如因植物珍贵或应客户需求，需针对管制的类病毒实施脱除处理。3.2植物类病毒脱除处理针对植物类病毒在植物体内分布不均匀、低温能够抑制类病毒增殖的特性，设计在低温条件下对植物进行处理加上茎尖分生组织培养，以脱去植物类病毒。4仪器和用具4.1仪器4.1.1超净工作台。4.1.2 天平(0. 001 g)。 SN/T 2475—20104.1.3解剖镜。4.1.4光照培养箱。4.1.5高压灭菌锅。4.1.6 pH计或 pH试纸。4.1.7 PCR 仪。4.1.8分子杂交箱。4.1.9电泳槽。4.2用具4.2.1量筒。4.2.2容量瓶。4.2.3接种针。4.2.4 镊子。5类病毒检测方法5.1生物学检测（指示植物法）。5.2往返聚丙烯酰胺凝胶电泳 returh。5.3 RT-PCR方法。5.4核酸杂交方法。6类病毒脱除处理程序6.1植株的低温处理将植株放在 2℃～7℃条件下光照或黑暗条件下连续处理6个月以上。6.2材料剪取与灭菌剪取经过低温处理的植株茎尖1cm～2cml自来水冲洗30／min，剥去外面的叶片。将茎尖置于超净工作台上，无菌条件下进行消毒：75%的乙醇浸泡10,s，已灭菌的蒸馏水冲洗3次～5次；再用0.1%的升汞浸泡材料,滴入 1滴～2 滴吐温，消毒时间 5min～15 mih,用灭菌的蒸馏水冲洗3次～5次，每次5 min。将处理过的材料放入灭菌的培养血中待用6. 3 茎尖剥离与接种将经过上一步处理过的茎尖放在解剖镜下，用已灭菌的解剖刀逐层剥去幼叶，直至出现顶端分生组织,将顶端分生组织和毗邻的1个～2个幼叶原基切下,直立向上接种到适宜的固体培养基上。参见附录A。6.4试管苗类病毒检测用上述类病毒的检测方法检测试管苗，如果检测结果为阴性则初步定为脱类病毒试管苗，进行后期的扩繁和生根移栽,如果检测结果为阳性则不是脱类病毒试管苗，需要再进一步进行类病毒脱除处理。6.5　试管苗的扩繁与生根培养6.5.1试管苗的扩繁检测结果为阴性的试管苗可接种到扩繁培养基上进行增殖。6.5.2生根培养试管苗长至 3 cm～5 cm 时转至生根培养基进行培养。6.6　试管苗的驯化将生长苗壮、有3片～5片叶的试管苗移至温室进行炼苗。2 SN/T 2475—20106.7移栽6.7.1 过渡培养取出试管苗,洗净根部培养基，移入适宜的栽培基质中，刚移栽后的试管苗要避光，湿度：85%，温度：白天25℃～28℃,夜间15℃～18℃。避光保湿培养2d～3d后在正