SN_T 4825-2017牛羊肝片吸虫病检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4825—2017牛羊肝片吸虫病检疫技术规范Quarantine protocol for Fasciolosis in bovine and sheep2017-07-21发布2018-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局3O 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准牛羊肝片吸虫病检疫技术规范SN/T4825—2017*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/16印张1字数26千字2018年7月第一版2018年7月第一次印刷印数1-500*书号：155066·2-33310定价21.00元 SN/T4825—2017前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准主要起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国内蒙古出人境检验检疫局。本标准主要起草人：吴绍强、王彩霞、赵治国、王海艳、吕继洲、林祥梅、赵林立、邓俊花、梅琳、崔强、敖威华、张晓东、陈宇飞。 SN/T4825—2017牛羊肝片吸虫病检疫技术规范1范围本标准规定了牛羊肝片吸虫虫卵和成虫的形态学检查、肝片吸虫抗体ELISA检测及荧光PCR检测等技术规范。本标准适用于牛羊等活动物肝片吸虫感染情况检测、牛羊肝脏等动物产品中肝片吸虫的检疫，也适用于牛羊养殖场肝片吸虫病的流行病学调查和监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出境动物检疫采样3疫病概述参见附录 A。4材料4.1除另有规定外，所用化学试剂均为分析纯。试验用水要求达到GB/T6682中一级水的要求。4.2饱和盐水溶液：配制方法见B.1。4.3福尔马林溶液：配制方法见B.2。4.4酸乙醇：配制方法见B.3。4.5德氏苏木素染液：配制方法见B.4。4.6荧光PCR反应液2×PreMix为商品化试剂盒中成分。4.7肝片吸虫抗体检测试剂盒：本标准以IDEXX公司生产的FasciolahepaticaAntibodyTestKit!为例进行操作，也可采用经过验证、检测效果确实的其他肝片吸虫ELISA检测试剂盒。4.8引物和探针：FasITS-F：5-ACCCTTGTCTTGGCAGAAAGC-3；FasITS-R：5-CAAACA-CACTGACAACTGAGTACC-3;FasITS-Q:5-FAM-ACCCGATTATTAAACCACGATTCCGC-CACT-ECLIPSE-3。引物和探针合成后均采用灭菌ddHzO稀释为10μmol/L，扩增片段长度为89bp（具体序列参见附录C)。4.9荧光PCR检测阴阳性对照：阳性对照为已知肝片吸虫样品；阴性对照为健康牛（羊）肝组织样品。5仪器设备与耗材5.1显微镜。1）FasciolahepaticaAntibodyTestKit是适合的市售产品的实例，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对这一产吕的认可。1 SN/T4825—20175.2动物解剖台。5.3载玻片。5.4恒温培养箱、振荡器。5.55酶联免疫检测仪、超净台。5.65实时荧光PCR仪。5.7一80℃超低温冰箱、一20℃冰箱、4℃冰箱。5.83高速冷冻离心机。5.9高压灭菌锅。5.10水浴锅。5.11制冰机。5.12吸管、微量移液器及配套的吸头。6检测方法6.1病原形态学检查6.1.1粪便检查符合GB/T18088。采取粪便样品10g，置于烧杯内，注人100mL密度为1.18g/cm的饱和盐水，用玻璃棒搅拌至均匀的混悬液，静置15min～20min。。用小铲除去浮于表面的粪渣。用吸管吸弃上清液。大量检查样品时，可将浮渣及上清液小心倒出，在杯底剩余20mL~30mL沉渣。向沉渣中加水至满杯，仔细用玻璃棒搅拌至混悬液。使用网眼直径为0.25mm的金属筛过滤混悬液，并使滤液静置5min，吸弃上清液，再用少量水洗涤烧杯，静置3min～5min，然后吸弃上清液，如此反复操作3～5次，最后用吸管将沉渣移于载玻片上，盖上盖玻片，在光学显微镜10倍物镜下循序镜检。6.1.2剖检按照常规的动物户体剖检操作步骤（见附录D)对死E亡动物进行剖检。急急性型可见幼虫移行时引起出血，腹腔和的肠壁、肝组织和其他器官的组织损伤和虫道”内可发现童虫。慢性型肝脏肿大，胆管呈、粗糙，有磷酸盐沉淀，肝实质变硬。绳索样凸出于肝表面，胆管壁发炎切开后在胆管内可见成虫，形似木